基于抗氧化活性分析的藍莓多酚提取工藝

趙慧芳,吳文龍,馬 麗,滕杰輝,姚 蓓,李維林

(江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇南京 210014)

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基于抗氧化活性分析的藍莓多酚提取工藝

趙慧芳,吳文龍,馬 麗,滕杰輝,姚 蓓,李維林*

(江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇南京 210014)

基于對藍莓不同極性溶劑(水、正丁醇、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯)提取物以及甲醇提取、大孔樹脂純化后的乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物抗氧化活性(DPPH和ABTS)的分析測定,優化并確定了藍莓多酚的提取工藝。實驗結果顯示,藍莓不同溶劑提取物對DPPH、ABTS自由基具有良好的清除能力,其活性成分主要集中在大極性的70%乙醇、甲醇和正丁醇部位,經過大孔樹脂純化后萃取得到藍莓不同極性多酚抗氧化活性強弱順序為:正丁醇>水>乙酸乙酯。藍莓提取物和萃取物的抗氧化能力與多酚含量有顯著的相關性,與花色苷含量無關。較大極性的提取和萃取溶劑有利于藍莓強效多酚的獲取。以抗氧化活性為導向的藍莓多酚提取工藝為:藍莓果實以含0.3%三氟乙酸的70%乙醇提取,提取液經LS-305大孔樹脂吸附,先用0.3%三氟乙酸水溶液沖洗去雜,再用含0.3%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫,洗脫液在40℃下減壓濃縮除去甲醇后用水溶解,以乙酸乙酯萃取去雜,再以正丁醇萃取,萃取液在60℃下減壓濃縮后冷凍干燥。

藍莓,抗氧化,多酚,花色苷

藍莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科越橘屬植物[1],其果實中含有豐富的糖、有機酸、氨基酸、花色苷、鞣花酸、維生素E、天然視紫質、類黃酮等特殊物質[2],酸甜適口,并有清爽宜人的香氣。近年來國內外臨床實驗表明,藍莓多酚成分具有很強的抗氧化活性,能夠促進視紅素再合成,具有改善循環、抗潰瘍、抗炎、提高機體免疫力、增強心臟功能、抗心血管疾病、延緩衰老、抗癌、抗突變[3-5]以及抑制細胞氧化損傷[6]、降低肝細胞脂肪積累[7]等功效。

近年來,關于藍莓花色苷色素的提取方法已有研究報道,包括乙醇溶液浸提[8]和乙醇超聲提取[9],對藍莓多酚粗提物及其抗氧化活性的研究也有報道[10-11],劉翼翔等[6]進一步對藍莓果實甲醇提取后XAD-7大孔樹脂和Sephadex LH-20葡聚糖凝膠樹脂純化、結合乙酸乙酯萃取的方法得到的不同組分多酚進行了研究。鑒于多酚類物質包括花色苷色素的熱不穩定性,在此類物質提取過程中,凍果破碎后直接提取的方法應用較為廣泛,但也有人主張采用熱燙工藝處理鈍化多酚氧化酶后以防止果汁的褐變,但結果發現加熱的同時也造成多酚物質的氧化及抗氧化活性的降低[12]。

超聲提取利用超聲波特有的空化現象以及空化中產生的極大壓力促進細胞壁破裂及細胞內有效成分的快速溶出,可以極大地提高提取效率,縮短提取時間[9]。本文在采用超聲波輔助提取的基礎上,比較了不同極性溶劑提取以及提取物大孔樹脂純化后再用不同極性溶劑萃取所得藍莓多酚的抗氧化活性,并以活性為導向確定了藍莓多酚的提取工藝,以期為藍莓多酚的開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓園藍(Garden blue)品種鮮果于2012年購于江蘇省溧水縣藍莓種植農戶,清洗后-18℃速凍,在江蘇泰州興野食品廠加工成凍干果。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) Sigma公司;ABTS(2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽) Sigma公司;沒食子酸標準品 國藥集團化學試劑有限公司;Folin-Ciocalteu’s 試劑 Sigma公司;其他試劑均為分析純。

PL-5-B型低速離心機 上海安亭科學儀器廠;KQ-100DE數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;Infinite M200型酶標儀 TECAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 藍莓粗提物:藍莓凍干果粉25g,分別以含0.3%三氟乙酸的5種溶劑(水、正丁醇、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯),料液比1∶5(g/mL),在30℃下超聲輔助提取(功率180W)3次,每次30min,第2、3次料液比減半。合并提取液,4500r/min離心5min,取上清,40～60℃減壓濃縮除去溶劑,浸膏冷凍干燥,得到樣品水提物(WE)、正丁醇提取物(BE)、甲醇提取物(ME)、乙醇提取物(EE)、乙酸乙酯提取物(AE)。

藍莓萃取物:藍莓凍干果粉100g,以含0.3%三氟乙酸的甲醇為溶劑,遵循上述提取步驟得到浸膏樣提取物,用500mL純凈水溶解、過濾,取300mL濾液上LS-305大孔樹脂柱(柱直徑2.5cm,流速約1.5BV/L),用0.3%三氟乙酸水溶液(約400mL)沖洗除去糖、酸等雜質,再用0.3%三氟乙酸甲醇溶液(約100mL)洗脫,收集洗脫液,40℃減壓濃縮至浸膏狀,用純凈水溶解并定容至150mL。取該樣品溶液25mL,40℃減壓濃縮至浸膏狀,冷凍干燥后得到藍莓總提取物(RP)。將其余125mL樣液依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取3次,第1次用等體積,后2次用二分之一體積,合并萃取液,40℃減壓濃縮除去溶劑,冷凍干燥后得到藍莓乙酸乙酯萃取物(ARP);正丁醇萃取4次,第1次用等體積,后3次用二分之一體積,60℃減壓濃縮除去溶劑,冷凍干燥后得到藍莓正丁醇萃取物(BRP),剩余水部位50℃減壓濃縮除去溶劑,冷凍干燥后得到藍莓水萃取物(WRP)。

1.2.2 抗氧化活性的測定

1.2.2.1 ABTS抗氧化實驗 ABTS工作液:稱取13.4mg ABTS,加入3930μL水溶解保存;ABTS儲存液:將5mL 7mmol/L ABTS和88μL 140mmol/L過硫酸鉀混合,在室溫避光條件下放置12～16h,形成ABTS儲備液。ABTS工作液吸光度值為0.5±0.02。取上述各種提取物,以二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成20mg/mL的母液。先進行樣品抗氧化活性的粗篩,在96孔板中,分別加入樣品母液2.5μL,用無水乙醇補至每孔50μL,然后再加入200μL ABTS工作液,反應體系250μL,30℃條件下振蕩1min,6min后測定其734nm下的吸光度(Ai);取50μL DMSO代替樣品溶液測得空白吸光度(AC);以200μL無水乙醇代替ABTS混合液測得樣品本底吸光度(Aj),計算樣品的清除率,清除率高于50%再進行IC50的測定。測定IC50時每個樣品設置4個以上的濃度,每個濃度重復3次,取平均值。以VC做對照,按公式(1)計算清除率,并計算出IC50值[13]。

式(1)

1.2.2.2 DPPH抗氧化實驗 取上述各種提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。DPPH用無水乙醇配制成0.16mmol/L,置于棕色瓶中備用。先進行樣品抗氧化活性的粗篩,在96孔板中分別加入樣品母液2μL,用無水乙醇補至100μL,再加100μL DPPH工作液,30℃下振蕩1min,10min后測定其517nm下的吸光度(Ai);取100μL無水乙醇代替樣品溶液測得空白吸光度(AC);以100μL無水乙醇代替DPPH工作液測得樣品本底吸光度(Aj),按公式(1)計算清除率,清除率高于50%再進行IC50的測定。測定IC50時每個樣品設置4個以上的濃度,每濃度重復3次,取平均值。

1.2.3 總花色苷和總多酚含量測定

1.2.3.1 總花色苷含量測定 花色苷在pH1.0下,510nm處有最大吸收,而當pH為4.5時,花色苷轉變為無色查爾酮形式,在510nm處無吸收,據此可以用示差法計算溶液中的總花色苷含量[14]。取上述各種提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。吸取2mL樣品液,分別用pH1.0[0.2mol·L-1KCl∶0.2mol·L-1HC1=25∶67(V/V)]和pH4.5[0.2mol·L-1NaAc·3H2O∶0.2mol·L-1HAc=1∶1(V/V)]的緩沖液稀釋至20mL,混勻,以2mL溶劑加18mL相應緩沖液作空白,分別在510nm和700nm處測定吸光值,并按下式計算稀釋樣品的吸光度(A):

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式(2)

然后按下式計算樣品液中花色苷色素的濃度(以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計)(C):

式(3)

果實總花色苷含量(ACY)按以下公式計算:

式(4)

其中:DF-稀釋因子,V-提取液的總體積,mL;m-取樣量,g;26900-矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數;449.2-矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾分子質量。

1.2.3.2 總多酚含量測定 標準曲線制作:準確稱取500.0mg沒食子酸,用純凈水溶解,定容至1000mL,分別移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、9.0、10.5、12.5、14.5mL到50mL容量瓶中,加水定容,其中沒食子酸的濃度分別為20、25、30、35、40、45、90、105、125、145mg·L-1。分別取不同濃度的標準溶液1.0mL,加入5.0mL 0.2mol·L-1Folin-Cioealteu’s試劑混合,在0.5～8min內加入4mL 7.5%(w/v)飽和碳酸鈉溶液,充分混合。將上述混合標準溶液在25℃下避光放置2h后,在765nm波長下測定吸光值。以吸光度Y為縱坐標,沒食子酸濃度X為橫坐標,繪制標準曲線。

樣品的測定:取上述各種提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。樣品液稀釋適當的倍數(4～8)進行測定。吸取1.0mL待測液至10mL試管中,加入5.0mL 0.2mol·L-1的Folin-Ciocalteu’s試劑,充分混勻,在0.5～8min內加入4mL 7.5%(w/v)飽和碳酸鈉溶液,25℃下放置2h后測定765nm下吸光度。根據回歸方程計算總多酚含量(以沒食子酸計)[15-16]。

1.3 數據處理

采用Excel2003分析軟件進行數據的統計與分析,并用Excel2003分析軟件繪制藍莓提取物對自由基的清除曲線。

2 結果與分析

2.1 對ABTS的清除作用

藍莓不同溶劑提取物和萃取物對ABTS自由基均有一定的清除能力(圖1、圖2)。不同溶劑提取物的ABTS自由基清除能力大小順序為70%乙醇(EE)>甲醇(ME)>正丁醇(BE)>乙酸乙酯(AE)>水(WE),其中水提物(WE)在200～1200μg/mL的濃度范圍內清除ABTS自由基能力隨濃度的升高而升高,IC50為837.77μg/mL,清除能力較弱,其余溶劑提取物均在較低的濃度范圍內即具有較高的清除能力,由此認為70%乙醇和甲醇是提取藍莓抗氧化活性成分的最優溶劑。經過甲醇提取、大孔樹脂純化后的藍莓總提取物(RP)清除ABTS自由基能力顯著增強,IC50僅為純化前甲醇提取物(ME)的17%。不同溶劑萃取物中正丁醇萃取物(BRP)清除ABTS自由基能力最強,IC50為1.41μg/mL,其次為水萃取物(WRP),乙酸乙酯萃取物(ARP)清除ABTS自由基能力稍弱,IC50為4.33μg/mL。

圖1 藍莓不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率Fig.1 ABTS free radical scavenging percentage of different solvent extracts from blueberry(Garden blue)

圖2 藍莓不同溶劑萃取物對ABTS自由基的清除率Fig.2 ABTS free radical scavenging percentage of liquid-liquid extracts after macroporous resin enrichment from blueberry(Garden blue)

2.2 對DPPH·的清除作用

藍莓各種提取物對DPPH自由基清除能力較弱(圖3),除甲醇提取物(ME)IC50為128.18μg/mL外,其余均未測得(表1)。經過甲醇提取、大孔樹脂純化后的藍莓總提取物(RP)清除DPPH自由基能力顯著增強,IC50僅為純化前甲醇提取物(ME)的27%。不同溶劑萃取物中正丁醇萃取物(BRP)的清除DPPH自由基能力最強,IC50為18.28μg/mL,乙酸乙酯萃取物(ARP)清除能力最弱,剩余水部位(WRP)清除DPPH自由基的IC50為45.75μg/mL,介于兩者之間(表1)。

圖3 藍莓不同提取物和萃取物對DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging percentage of different extracts from blueberry(Garden blue)

2.3 各提取物中的總花色苷和總多酚含量

標準曲線測定結果發現總多酚含量(以沒食子酸計,Y)與吸光度(765nm,X)的回歸方程為:y=0.01089x-0.23431,R2=0.9989,表明沒食子酸濃度在20～145mg/L范圍內線性關系良好,據此計算樣品的總多酚含量。由表2可以看出,藍莓不同溶劑粗提取物中總花色苷含量的高低順序為70%乙醇>正丁醇>甲醇>乙酸乙酯>水,總多酚含量的高低順序為甲醇>70%乙醇>乙酸乙酯>正丁醇>水。由此可見,選用70%的乙醇、甲醇作為藍莓果實抗氧化活性物質的提取溶劑較好。根據所得提取物干重占原料干果粉重的百分比計算得率見表2，從提取物得率上來看甲醇>70%乙醇，但考慮到甲醇的毒性,生產中可用70%乙醇作提取溶劑，本文后續實驗則選擇了提取效率最高的甲醇作提取溶劑。

表1 藍莓提取物和萃取物對DPPH·和 ABTS的半數清除濃度Table 1 The IC50 of different extracts from blueberry(Garden blue)to scavenge DPPH and ABTS radicals

表2 藍莓不同提取物和萃取物總花色苷和總多酚含量Table 2 Total phenolics and total anthocyanins content of different extracts from blueberry(Garden blue)

經過甲醇提取大孔樹脂純化后的樣品(RP)總花色苷含量達80.29mg/100g,較純化前提高了4.3倍,總多酚含量達617.25mg/g,較純化前提高了7.6倍。不同溶劑萃取物中,總花色苷含量高低順序為正丁醇>水>乙酸乙酯,差異較大,總多酚含量的高低順序為水>正丁醇>乙酸乙酯,差異較小。乙酸乙酯萃取物得率較低,其中的多酚含量較高,花色苷含量較低,可見乙酸乙酯部位主要為非花色苷類的多酚,跟文獻比對,這部分可能為黃酮組分[7]。正丁醇是富集花色苷及多酚的良好溶劑,得率較高。綜合分析上文ABTS和DPPH清除率數據可以發現,乙酸乙酯、正丁醇和水部位的清除自由基能力強弱為正丁醇>水>乙酸乙酯(表1),同總花色苷含量的高低順序是一致的,因此可以考慮在以多酚為提取目標的工藝中先用乙酸乙酯萃取,除去非花色苷類雜質,然后用正丁醇作為溶劑富集藍莓花色苷及多酚,以獲得藍莓抗氧化活性較高的成分。

2.4 相關性分析

分別考察了藍莓提取物與抗氧化活性間的相關性及總多酚、總花色苷含量與抗氧化活性的相關性。結果發現,藍莓提取物清除DPPH和ABTS自由基的IC50值成極顯著相關(表3),即提取物對兩種自由基的清除活性基本一致。

表3 藍莓提取物ABTS和DPPH抗氧化活性間的相關系數Table 3 Correlation coefficient of antioxidant activities of blueberry extracts between ABTS and DPPH

注:**表示在0.01水平上顯著相關。

由表4可見,藍莓各提取物對DPPH自由基的清除能力與總多酚含量之間呈顯著相關,即在一定范圍內,總多酚含量越高,對DPPH自由基的清除能力越強;各提取物對DPPH自由基的清除能力與總花色苷含量無相關性;各提取物對ABTS自由基的清除能力與總多酚和總花色苷含量均沒有相關性。

表4 藍莓提取物抗氧化活性和總多酚、 總花色苷含量的相關系數Table 4 The correlation coefficient of the antioxidant activity and the content of total phenolics and total anthocyanins blueberry extracts

注:*表示在0.05水平上顯著相關。

3 討論與結論

藍莓提取物對DPPH、ABTS自由基有良好的清除能力,其活性成分主要集中在70%乙醇、甲醇和正丁醇部位。經自由基清除能力與總多酚和總花色苷含量的相關性分析顯示,藍莓提取物的抗氧化活性與總多酚含量呈顯著相關,與總花色苷含量沒有相關性。藍莓不同溶劑萃取物的抗氧化活性強弱順序為正丁醇>水>乙酸乙酯,與蘋果多酚抗氧化活性的研究結果不同[17]。

由于藍莓果實的抗氧化活性與其中的多酚含量顯著相關,所以可以以抗氧化活性為導向優化藍莓多酚提取和純化的工藝。本研究中藍莓各種溶劑的粗提物中多酚含量較低,經大孔樹脂富集后多酚含量大幅度提高。大孔樹脂富集后各種溶劑的萃取物中,多酚含量略有下降,抗氧化活性表現不一,其中正丁醇萃取物對DPPH自由基清除的IC50最低,為18.28μg/mL,表明抗氧化能力最強。實驗數據也顯示,正丁醇萃取物得率較高,其中的多酚含量也較高。綜合考慮提取成本和安全因素等,可以確定以抗氧化活性為導向的藍莓多酚提取工藝為:藍莓果實以含0.3%三氟乙酸的70%乙醇提取,提取液經LS-305大孔樹脂吸附,先用0.3%三氟乙酸水溶液沖洗去雜后,再用含0.3%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫,洗脫液在40℃下減壓濃縮除去溶劑后用水溶解,以乙酸乙酯萃取去雜,再以正丁醇萃取,萃取液在60℃下減壓濃縮,冷凍干燥。

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Separation of polyphenols from blueberry basedon antioxidative activities

ZHAO Hui-fang,WU Wen-long,MA Li,TENG Jie-hui,YAO Bei,LI Wei-lin*

(Institute of Botany,Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014,China)

Based on the determination of antioxidative activity,the extraction procedure of higher pure polyphenol from blueberry was optimized. The crude extracts were obtained by using different polar solvents(water,n-butyl alcohol,70% ethanol,methanol,ethyl acetate)from blueberry fruit. The ethyl acetate,n-butyl alcohol and water liquid-liquid extracts were orderly obtained from macroporous resin enrichment material after methanol extracted. The antioxidative activity of these extracts were measuredinvitroby the method of DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)and ABTS(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazolne-6-sulfonic)). The results showed that all these extracts had antioxidative activity,the active components of the crude extracts mainly existed in methanol,70% ethanol and n-butanol parts. The antioxidative activities of liquid-liquid extracts after macroporous resin enrichment order by polyphenols extracted with n-butanol>those extracted with water>those extracted with ethyl acetate. The activity of these extracts was significantly correlated with total polyphenol content,not with total anthocyanin content. This showed that blueberry polyphenols with strong free radical scavenging effects can be obtain with polar solvent. The optimal blueberry polyphenol extraction procedure based on antioxidative activity was confirmed as:blueberry was extracted with 70% ethanol containing 0.3% trifluoroacetic acid,then absorbed with LS-305 macroporous resin,firstly eluted with aqueous solution congtaining 0.3% trifluoroacetic acid to remove impurities,then eluted with methanol containing 0.3% trifluoroacetic acid,the eluent was concentrated at 40℃ under reduced pressure to remove solvents and then redissolved in water,extracted with ethyl acetate to remove impurities again,the rest was extracted with n-butanol,concertrated the n-butanol part at 60℃ under reduced pressure and freeze-drying.

blueberry;antioxidant activities;polyphenol;anthocyanin

2014-05-28

趙慧芳(1984- )，女，碩士，助理研究員，主要從事果品加工研究工作。

*通訊作者:李維林(1966-)，男，博士，研究員，研究方向:經濟植物引種馴化、資源評價和開發利用。

江蘇省產學研聯合創新資金項目(BY2011198)；南京市科技發展計劃(201301060)；江蘇省農業三新工程項目(SXGC[2013]347)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)05-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.044