微波輔助提取柑幼果總黃酮工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

張文娟,潘靈剛,陶 緣,王亞軍,李 昕,王瑞花,陳健初,5,*,葉興乾,5

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 3100582.浙江省食品加工技術與裝備工程中心,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058;4.西安航空學院理學院,陜西西安 710077;5.浙江大學馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

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張文娟1,2,3,潘靈剛4,陶 緣1,2,3,王亞軍1,2,3,李 昕1,2,3,王瑞花1,2,3,陳健初1,2,3,5,*,葉興乾1,2,3,5

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 3100582.浙江省食品加工技術與裝備工程中心,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058;4.西安航空學院理學院,陜西西安 710077;5.浙江大學馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

應用微波輔助提取椪柑幼果中的總黃酮。研究微波功率、乙醇體積分數(shù)、微波時間及液固比四個單因素對于總黃酮提取量的影響,并利用正交實驗設計對總黃酮的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化,評價椪柑幼果的微波提取液對于DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明:在微波功率616W,乙醇體積分數(shù)50%,微波時間40s,液固比30(g/mL)的提取條件下,重復三次實驗,椪柑幼果中總黃酮的平均提取量達到24.9452mg RT/g DW。椪柑幼果微波提取液的濃度為0.67mg/mL時,TEAC值為13.3054mg/g DW,對DPPH·的清除率可以達到48.4023%,椪柑幼果微波提取液對DPPH·有一定的清除作用。

椪柑,總黃酮,微波輔助提取,DPPH·

柑橘為世界水果產(chǎn)量之首,是第三大國際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[1]。我國柑橘栽培面積世界第一、產(chǎn)量居第三位,資源豐富,品種多產(chǎn)量大。柑橘果實中含有葉酸、類胡蘿卜素等維生素,柑橘類黃酮具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌等生理功能[1-3]。柑橘中所含有的黃酮類物質(zhì)主要為黃烷酮、黃酮、黃酮醇及僅存在于血橙中的花色苷,黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降低毛細血管脆性、抗過敏、預防動脈粥樣硬化和膽固醇增加等多方面的藥理作用[1,3]。

目前相關文獻報道柑橘中黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有:醇浸提法、加熱回流提取法、閃式提取法、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、高速逆流色譜法和超濾法[2,4]。其中微波輔助提取較傳統(tǒng)回流提取和超聲提取相比,具有操作簡便,大大縮短提取時間,節(jié)能環(huán)保[4]。

由于各種原因每年有大量的柑橘幼果在成熟前脫落[5],僅貴州省的桐梓縣每年就有0.8萬噸的柑橘落果[6],因而柑橘幼果成為具有工業(yè)化生產(chǎn)價值的原料。本文選取的是浙江省產(chǎn)量較大的柑橘品種之一椪柑,于落果期收集椪柑幼果,在單因素的基礎上進行正交實驗設計,探究微波輔助提取椪柑幼果總黃酮的最佳工藝,并對該工藝條件下的提取液的抗氧化活性進行研究,為椪柑幼果的綜合開發(fā)利用提供理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椪柑幼果(CitruspoonensisHort. ex Tanaka) 購自浙江省衢州市某公司;蘆丁,二苯代苦味酰(DPPH),水溶維生素E(Trolox) 購于美國Sigma公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為國產(chǎn)分析純,購自Aladdin公司。

DFT-50型粉碎機 浙江溫嶺市林大機械有限公司;GB204電子天平 瑞士Mettler Tikedo公司;MM823EE3-PW美的微波爐 廣東美的微波電器制造有限公司;UV-2550紫外-可見光分光光度計 曰本島津公司;DHG-9070A烘箱 杭州藍天化驗儀器廠;循環(huán)水真空泵 SHZ-III上海亞榮儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 椪柑幼果中總黃酮提取的工藝路線 椪柑幼果→60℃烘干→過篩→與乙醇溶液混合→微波提取→過濾→測定總黃酮含量。

1.2.2 操作方法 椪柑幼果粉碎后,過80目篩和200目篩,收集截留在兩篩之間的椪柑粉末。在一定的乙醇溶液、微波功率、微波時間、液固比的條件下進行微波提取,過濾,濾液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總黃酮含量的測定 參考Kim等的方法,并稍作改動[7]。標準曲線:精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁標準品25.04mg,置于100mL棕色容量瓶中,用30%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成0.2504mg/mL的標準溶液。分別精確移取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mL標準溶液至25mL比色管內(nèi),用30%的乙醇補充體積至5mL,漩渦震蕩使之混勻,分別加入0.3mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置5min,加入0.3mL濃度10%的硝酸鋁溶液,震蕩混勻后靜置6min,加4mL濃度為1mol/L氫氧化鈉溶液,補加30%乙醇溶液使反應體系的總體積為10mL,震蕩混勻,暗處靜置10min后,在510nm下測定吸光度,以30%乙醇作為空白參比。

椪柑幼果微波提取液中總黃酮的測定,取0.4mL提取液于25mL比色管中,補加4.6mL的30%乙醇,其余操作按照標準曲線的顯色方法進行,總黃酮含量用蘆丁當量RT(Rutin equvalent)表示。

1.2.4 總黃酮含量計算公式 椪柑幼果總黃酮含量(mg RT/g DW)=提取液中總黃酮含量(mg RT)/椪柑幼果粉末的質(zhì)量(g)

1.2.5 單因素實驗 準確稱取1.0g椪柑幼果粉末于100mL錐形瓶中,加入20mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液,微波功率為440W,微波時間為40s作為進行單因素實驗的基礎條件。當研究某一單因素時,其他條件保持不變。設置微波爐分別為低火、中低火、中火、中高火、高火檔,根據(jù)美的MM823EE3-PW微波爐使用說明書,計算出提取椪柑幼果黃酮時的相應微波功率分別為136、264、440、616、800W,考察上述不同的微波提取功率,乙醇體積分數(shù)(10%、30%、50%、70%、90%)、微波時間(0、20、40、60、80s)、液固比(10、20、30、40、50mL/g)等因素對提取液中黃酮提取量的影響,確定各因素的最優(yōu)范圍。

1.2.6 正交實驗 在單因素實驗基礎上,選擇微波功率、乙醇體積分數(shù)、微波時間、液固比為椪柑幼果總黃酮提取量的影響因素,采用L9(34)正交實驗對提取條件進行優(yōu)化,因素水平見表1,確定最佳提取工藝。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 DPPH自由基的清除作用 通過測定抗氧化物質(zhì)與DPPH·反應而顏色變淺來反映清除自由基能力,以Trolox當量(TEAC)或半抑制濃度(IC50)表示抗氧化能力。該方法操作簡單,被廣泛應用于定量測定植物提取物、食品成分和其它活性成分的抗氧化能力。

參考Gorinstein等的方法,并稍作改動[8]。椪柑幼果微波提取液清除DPPH·能力的測定,將椪柑幼果的微波提取液用乙醇稀釋至適宜濃度,移取2.8mL的DPPH·溶液,加入0.2mL稀釋后的提取液,震蕩充分混合,室溫避光反應30min,于517nm下測定吸光度,空白對照為0.2mL乙醇溶液。以濃度范圍為20～160μg/mL 的Trolox乙醇溶液為標樣,測定吸光度,并以吸光度和Trolox濃度作標準曲線,椪柑幼果的微波提取液抗氧化能力用DPPH·清除率和Trolox當量(TEAC)兩種方法來表示。

式中:A1為所測柑橘幼果微波提取液的吸光值；A2為空白對照品吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線繪制

如圖1所示,以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得到標準曲線方程:

y=11.6243x-0.0005,相關系數(shù)r=0.9999,表明線性關系良好。

圖1 總黃酮標準曲線Fig.1 Standardcurve for total flavonoid content

2.2 微波提取的單因素實驗

2.2.1 微波功率對椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著微波功率的增大,椪柑幼果總黃酮的提取量隨著也增大,在功率超過616W之后隨著微波功率的增大,黃酮提取量下降。馮紀南等研究微波輔助提取資興柑橘皮中總黃酮的工藝條件發(fā)現(xiàn),當微波功率超過600W時會造成黃酮提取量下降,與本實驗研究結(jié)果基本一致。隨著溫度的升高,溶劑的表面張力和粘性都會有所降低,細胞快速破裂,從而使溶劑的滲透力和對樣品的溶解力增加[9-10],但是過高的功率,局部瞬間高溫會使椪柑幼果粉末中的蛋白質(zhì)凝固,從而不利于黃酮的溶出[11-12]。因此,在本研究中,總黃酮提取的最佳微波功率為616W。

圖2 微波功率對黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of microvavepower on flavouoid yield

2.2.2 乙醇體積分數(shù)對椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,總黃酮提取量逐漸增加;當乙醇體積分數(shù)在50%～70%時,總黃酮提取量處于較高水平,當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大,總黃酮提取量明顯下降。微波加熱時,主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,乙醇體積分數(shù)過大濃度減少了料液中水的比例,會使料液升溫減慢,使得黃酮的含量降低[13]。因此本實驗中乙醇體積分數(shù)為70%較為適宜。

圖3 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

2.2.3 微波提取時間對椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖4可知,隨著微波提取時間的增加,總黃酮提取量先增加后降低,提取時間為40s提取量最高,超過40s后,微波處理時間的增加導致熱量急劇增加,高溫導致蛋白質(zhì)及雜質(zhì)的沉淀,從而影響黃酮的溶出,同時,時間過長導致液體沸騰,造成溶劑浪費,帶走目標產(chǎn)物[9],因此,選擇微波處理時間為40s。

圖4 微波提取時間對果膠得率的影響Fig.4 Effect of extractingtime on flavonoid yield

2.2.4 液固比對椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖5可知,總黃酮提取量隨著液固比的增大而增加,當液固比大于20mL/g時,總黃酮提取量則隨著液固比的增大而減小。液固比增大能夠加快傳質(zhì)過程,但是,溶劑的增加同時也稀釋提取物黃酮的濃度,提取量反而下降。因此,選擇液固比為20mL/g。

圖5 液固比對黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on flavonoi dyield

2.3 正交實驗設計

2.3.1 實驗的極差分析 正交實驗設計與結(jié)果如表2所示,極差R值大小反映因素對于實驗結(jié)果的影響大小,R越大,則表明該因素對于總黃酮提取量的影響越大。由極差分析可知,四個因素對于椪柑幼果中總黃酮提取量的影響主次順序為B>D>C>A,即:乙醇體積分數(shù)>液固比>微波時間>微波功率。由此可以確定最佳工藝條件為A3B1C2D3,即微波功率616W,乙醇體積分數(shù)50%,微波時間40s,液固比30(g/mL)。按照最佳工藝參數(shù)進行重復性實驗3次,發(fā)現(xiàn)椪柑幼果中總黃酮的提取量達到24.9452mg RT/g DW,均高于其他各正交實驗值。說明該優(yōu)化工藝條件合理科學,穩(wěn)定可靠。

表2 正交實驗設計結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

2.4 椪柑幼果總黃酮的抗氧化活性

DPPH·清除實驗中,摸索出椪柑幼果微波提取液稀釋50倍較為合適,質(zhì)量濃度為0.67mg/mL。吸光度y與Trolox濃度x之間的回歸方程:y=-0.031x+1.080,相關系數(shù)r=0.9995,表明線性關系良好。通過回歸方程計算出提取液的TEAC當量為13.3054TEAC mg/g DW。當椪柑幼果微波提取液濃度為0.67mg/mL時,通過1.2.7中DPPH·清除率的計算公式算出提取液對DPPH·的清除率可以達到48.4023%,具有一定的抗氧化活性。

徐貴華[14]將成熟椪柑果皮的甲醇超聲輔助10min后所得提取液,測定對于DPPH·的清除作用,其TEAC值為8.7TEAC mg/g DW。張元梅將成熟期的椪柑果皮和果肉分別用80%甲醇震蕩提取12h后,測定對于DPPH·的清除作用,其TEAC值分別為9.10、3.13TEAC mg/g DW[15]。說明了在DPPH體系中,椪柑幼果較成熟期果實具有較強的抗氧化能力,微波提取相比于超聲提取和震蕩提取具有節(jié)省時間,提取效率較高。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗,確定了微波提取椪柑幼果中的總黃酮的最佳工藝參數(shù),在微波功率616W,乙醇體積分數(shù)50%,微波時間40s,液固比30(mL/g)的提取條件下,重復三次實驗,椪柑幼果中總黃酮的平均提取量達到24.9452mg RT/g DW,各因素對提取量的影響主次順序依次為乙醇體積分數(shù)>液固比>微波時間>微波功率。微波提取椪柑幼果總黃酮能夠有效縮短提取時間,操作簡便等優(yōu)點。同時應該注意的是微波輔助提取活性成分的過程要謹慎選擇可靠的參數(shù)條件及優(yōu)化最佳工藝。

在DPPH體系中,椪柑的微波提取液稀釋50倍后測定體外抗氧化活性。測定結(jié)果表明為13.3054TEAC mg/g DW,DPPH·的清除率可以達到48.4023%,表明椪柑幼果的乙醇微波提取液具有一定的抗氧化活性。因此微波提取椪柑幼果具有一定的研究開發(fā)潛力與價值,本文為椪柑幼果的綜合開發(fā)應用提供了理論依據(jù)。

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Study on the optimization of the microwave-assisted extraction oftotal flavonoid and antioxidant capacity in young fruits ofPonkan(CitruspoonensisHort. ex Tanaka)

ZHANG Wen-juan1,2,3,PAN Ling-gang4,TAO Yuan1,2,3,WANG Ya-jun1,2,3,LI Xin1,2,3,WANG Rui-hua1,2,3,CHEN Jian-chu1,2,3,5,*,YE Xing-qian1,2,3,5

(1. College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2. Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing,Hangzhou 310058,China;3. Zhejiang R & D Center for Food Technology and Equipment,Hangzhou 310058,China;4. Faculty of Science,Xi’an Aeronautical University,Xi’an 710077,China;5.Fuli Institute of Food Science,Hangzhou 310058,China)

Orthogonal design was used to optimize the microwave-assisted extraction of total flavonoid from young fruits ofCitruspoonensisHort. ex Tanaka. Flavonoid yield was investigated with respect to four process conditions including microwave power,ethanol concentration,solid-to-solvent ratio and microwave time. The antioxidant activity of the ethanol extract was evaluated by DPPH· assays. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:616W of microwave power,50% of ethanol concentration,40s of microwave treatment time,and 30(g/mL)of solid-to-solvent ratio. Validation experiments were carried out at these optimum conditions and the results indicated that the total flavonoid yield was 24.9452mg RT/g DW. The result indicated that the ethanol extract possessed antioxidant with the TEAC value of 13.3054mg/g DW and the radical scavenging activity 48.4023% at 0.67mg/mL.

CitruspoonensisHort. ex Tanaka;total flavonoid;microwave-assisted extraction;DPPH·

2014-05-15

張文娟(1989-),女,碩士生在讀,研究方向:柑橘功能成分研究。

*通訊作者:陳健初(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品加工與工程。

國家科技攻關項目;柑橘加工副產(chǎn)物高效轉(zhuǎn)化關鍵技術研究及產(chǎn)業(yè)化示范(2012BAD31B02)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)05-0223-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.038