酵母膏對α-溶血性鏈球菌發酵代謝甘露聚糖肽的影響

許 翠,熊 秋,吳 佳,高夢祥,2,*

(1.長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025;2.長江大學荊楚特色食品研發中心,湖北荊州 434025)

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酵母膏對α-溶血性鏈球菌發酵代謝甘露聚糖肽的影響

許 翠1,熊 秋1,吳 佳1,高夢祥1,2,*

(1.長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025;2.長江大學荊楚特色食品研發中心,湖北荊州 434025)

研究發酵培養基中酵母膏的添加量對α-溶血性鏈球菌生長及其代謝甘露聚糖肽的影響規律。結果表明:當酵母膏的添加量小于7g/L時,隨著酵母膏添加量的增加,α-溶血性鏈球菌的菌落數明顯增加,最大菌落數為1.9×109,比對照組7.6×108增加了1.5倍,而且α-溶血性鏈球的延遲期由8h縮短到5h之內,對數期的生長速率由2.83增加到11.02,進入穩定期的時間也由27h以上縮短到23h。當酵母膏添加量大于7g/L時,這一規律就不再明顯。同時,酵母膏使菌體量快速增加的時間提前了2～4h,當酵母膏添加量為7g/L時,在發酵4h時,比生長速率最大,為0.38;在發酵27h時,甘露聚糖肽的代謝量最大,為1.04g/L。

α-溶血性鏈球菌,發酵,酵母膏,甘露聚糖肽

酵母膏是以新鮮啤酒酵母乳液經酶解分離、濃縮得到的純天然制品。它是由氨基酸、肽類、水溶性維生素及酵母多糖、酵母核酸組成的一種混合物,是各種微生物所必需的生長元素。在培養基中的主要作用是補充氮源和提供生長所需的多種維生素和氨基酸。酵母膏常常作為主要成分來優化微生物培養基,而單獨探討酵母膏對微生物的生長及其代謝產物的影響的報道還相對較少。Suarez[1]的研究表明了酵母膏能提高大腸桿菌分批發酵培養的發酵能力。Amrane[2]報道了分批培養中酵母膏濃度對瑞士乳桿菌生長和代謝產物的耦合效應。Pereira[3]探討了酵母膏對紫紅曲霉生長動力學和代謝紅色素產量的影響規律,結果表明含酵母膏的培養基中細胞生物量和紅曲色素的產量較對照組(不含酵母膏的培養基)均較高,而對照組所產的水溶性紅曲色素的含量要稍高些。

α-溶血性鏈球菌(α-hemalyticstreptococci)是鏈球菌中的一類條件致病菌[4-5],該菌經深層發酵可產生甘露聚糖肽。甘露聚糖肽是一種具有多種生物活性的糖肽類物質,是我國獨立研制的具有自主知識產權的新型免疫增強劑,具有改善和增強機體的應激機能,能減輕放療化療的毒副作用,增強和調節患者的免疫功能,升高白細胞和血小板,提高近期療效[6-10]。其對再生障礙性貧血、特發性血小板減少性紫癜、血細胞減少癥、感染過敏性關節炎、多種口腔粘膜病、兒童反復吸道感染等非腫瘤疾患均有較好的療效[11-13]。因此,如何提高甘露聚糖肽發酵產量成為了近年來國內外研究的熱點,而發酵培養基配方優化[14-15]和甘露聚糖肽的提取方法報道較多[16-18]。然而,單獨討論酵母膏對α-溶血性鏈球菌生產及代謝甘露聚糖肽的影響未見報道。本研究欲探討發酵培養基中酵母膏的用量對α-溶血性鏈球菌生長及代謝甘露聚糖肽的影響規律,為深入研究甘露聚糖肽的發酵條件提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

1.1.1 菌種來源 α-溶血性鏈球菌(α-Hemolyticstreptococcus)長江大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 實驗藥品 葡萄糖、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化鈉、氫氧化鈉、濃硫酸、D-甘露糖、α-萘酚、無水乙醇等。

1.1.3 所配試劑 無菌生理鹽水:稱取0.9g氯化鈉溶解于100mL蒸餾水中,轉入250mL的錐形瓶加塞封口后于立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌121℃,25min。滅菌后低溫保藏,以備重復使用。

0.1mol/L的NaOH溶液:稱取0.4g NaOH溶解于100mL蒸餾水中,封好瓶口,低溫保藏,以備重復使用。

1.1.4 儀器與設備 XYQ-LS-50B立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;5PX-250B5-II生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;PCDX-W-20超純水機 成都品成科技有限公司;UV-3300PC紫外可見分光光度儀 上海美譜達儀器有限公司;PICO-117離心機 Germany;HZ250LBG恒溫光照搖床 武漢瑞華儀器設備有限責任公司;DL-820B智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司;pH-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;HFsafe-1200生物安全柜 上海力申科學儀器有限公司;A型雙層鐵皮電爐 上海申航五金電器廠丹陽分廠;LG4-218L中雪豪華立式冷藏陳列柜 佛山市南海中雪制冷設備有限公司;TE124S型電子天平 METTLER-TOLEDO 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 試管液體菌種培養基:葡萄糖0.5%,胰蛋白胨0.5%,蛋白胨0.5%,酵母膏0.3%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,瓊脂0.5%,pH7.2。每支試管裝量10mL,滅菌121℃,20min。

搖瓶種子培養基:葡萄糖2.0%,蛋白胨1.0%,酵母膏1.0%,牛肉膏0.5%,氯化鈉1.0%,pH 7.5。裝瓶量40%,滅菌121℃,30min。

發酵培養基:蛋白胨0.3%,牛肉膏1.0%,氯化鈉0.5%,酵母膏,pH 7.2。裝瓶量小于50%,滅菌121℃,25min。

1.2.2 菌種預處理 菌種活化:將血平板中的菌種于無菌室接入試管液體培養基中,在37℃下,培養18～24h,經無菌考查和形態學鑒定合格后再接入試管液體培養基中,37℃培養18～24h,反復兩次。挑選生長旺盛、活力強、形態特征等符合要求的菌種,活化后的菌種如不及時使用,則需將其在2～4℃冰箱中保存。菌種活化目的在于提高活力。

搖瓶種子的制備:將優良的試管液體菌種,按0.2%的接種量在無菌條件下接入搖瓶培養基中,靜置37℃下,培養24h,鏡檢,長勢良好,無雜菌。制備搖瓶種子的目的在于提高菌種的活力,以便于以后的接種。

1.2.3 發酵培養與指標測定 發酵培養:將搖瓶種子在無菌條件下分別接種到不同的發酵培養基(蛋白胨3g/L,牛肉膏10g/L,氯化鈉5g/L,酵母膏的添加量分別為0、3、5、7、9、11g/L,pH調至7.2,121℃滅菌25min)中,置于37℃、轉速為150r/min恒溫搖床中培養。分別測定發酵時間為2、4、6、8、11、14、17、20、23、27、30h的發酵液中的活菌數和甘露聚糖肽的吸光值。

活菌數的測定:制備不同濃度的α-溶血性鏈球菌菌懸液,以血瓊脂平板測定其菌落數,并作為縱坐標,同時測定這些菌懸液在405nm處的吸光值,并作為橫坐標,得到回歸方程為y=149.7x+8.947,R2=0.908。吸取不同時間段的發酵液0.5mL,加入無菌生理鹽水2mL,搖勻制成5倍稀釋液,在405nm處測定其吸光值,由回歸方程計算出活菌數。

甘露聚糖肽的測定:稱取經105℃恒重的D-甘露糖10mg,置100mL容量瓶中,加水使溶解至刻度,搖勻得100μg/mL標準溶液。再精密量取標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分別置試管中,用水稀釋至2mL,各加2.5% α-萘酚溶液0.5mL,搖勻并置冰水中冷卻,加入濃硫酸5mL,快速搖勻后立即放入沸水浴中煮沸3min,再移置冰水浴中冷卻,10min后在570nm處進行比色,測定其吸收度,以此吸光度為縱坐標,甘露聚糖肽的含量為橫坐標,得回歸方程 y=0.7457x-0.0201,R2=0.9974。

吸取不同時間離心后的發酵液1.0mL,用蒸餾水稀釋至30mL。再精密量取稀釋液1.0mL,用水稀釋至2mL,依據標準曲線方法在570nm處進行比色,測定吸光度,由回歸方程計算甘露聚糖肽含量[16]。

1.2.4 數據統計與分析 采用Excel 2003進行數據錄入、簡要計算和圖表繪制。統計分析采用SPSS軟件進行,每次實驗至少3次重復,平均值顯著性水平為5%,菌體比生長速率(表1)的結果中用字母a-e表示。

2 結果與分析

2.1 酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌生長的影響

發酵20h時,菌落數隨酵母膏添加量的變化規律,如圖1所示。從圖1中可以看出,發酵培養基中酵母膏的添加量很明顯地影響α-溶血性鏈球菌的生長。以0g/L為對照組,當酵母膏的添加量從3g/L到7g/L時,α-溶血性鏈球菌的菌落數由8.9×108增加到1.6×109,是對照組5.1×108的1.7到3.1倍,影響顯著。當酵母膏添加量從7g/L增加到11g/L時,酵母膏對其生長的影響不明顯,所以7g/L的酵母膏添加量能夠滿足α-溶血性鏈球菌的生長需求。

表1 酵母膏添加量對菌體比生長速率的影響(1/h)Table 1 Effect of yeast extract on specific growth rate of α-hemolytic streptococcus(1/h)

圖1 酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌生長的影響 (發酵時間為20h)Fig.1 Effect of yeast extract on the number of colonies of α-hemolytic streptococcus at fermentation time 20h

酵母膏的添加量對α-溶血性鏈球生長曲線的影響如圖2所示,由圖2可知,隨著酵母膏添加量的增大,α-溶血性鏈球的延遲期越來越短,對數期的生長速率由2.83增加到11.02,進入穩定期的時間也由28h以上縮短到23h。當酵母膏添加量大于7g/L時,這一規律就不再明顯。

圖2 酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌生長曲線的影響Fig.2 Effect of yeast extract on growth curves of α-hemolytic streptococcus

酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌的比生長速率的影響變化如表1所示。在表1中以0g/L的酵母膏含量為對照,對相同的發酵時間條件下,酵母膏添加量對菌體比生長速率進行了顯著性分析。由表1可知,酵母膏對α-溶血性鏈球菌的比生長速率都具有較大的促進作用。酵母膏的添加量越多,越促進該菌的生長,最大比生長速率越大,達到最大比生長速率的時間也提前。以0g/L的酵母膏含量為對照,當酵母膏的添加量為3g/L時的最大比生長速率到達時間與對照組的時間一致,同為6h,最大比生長速率比對照組增加17.6%。5g/L和7g/L時的最大比生長速率比對照組提前2h到達,最大比生長速率分別比對照組增加33.3%和41.6%。當酵母膏添加量為9g/L和11g/L時,最大比生長速率比對照提前4h到達,最大比生長速率分別比對照組增加23.9%和30.3%。表明酵母膏使菌體量快速增加的時間提前,這一結果也驗證了圖2所示的規律。所以,考慮最大比生長速率,選擇7g/L的酵母膏添加量作為發酵培養基的最適添加量。

2.2 酵母膏添加量對甘露聚糖肽代謝的影響

發酵20h時,酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌代謝的甘露聚糖肽的影響如圖3所示。從圖中可以看出,添加酵母膏時,甘露聚糖肽的代謝量遠高于對照組。當酵母膏添加量為7g/L時,甘露聚糖肽代謝量最大,達到0.718g/L。當酵母膏添加量在9、11g/L時,甘露聚糖肽的代謝量反而略有下降,這可能因為培養基酵母膏含量過高,會破壞培養基的營養協調,影響微生物生長的微環境,反而不利于微生物的生長代謝[19]。由此可得出:α-溶血性鏈球菌生產出最多的甘露聚糖肽時,發酵培養基中酵母膏添加量為7g/L。

圖3 酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌 代謝甘露聚糖肽的影響 (發酵時間為20h)Fig.3 Effect of yeast extract on α-hemolytic streptococcus producing mannan peptide at fermentation time 20h

從酵母膏添加量對α-溶血性鏈球菌代謝的甘露聚糖肽代謝曲線的影響(圖4)可知,對照組甘露聚糖肽的最大值代謝量發生在發酵16h左右,即在α-溶血性鏈球菌處于對數期的中期。發酵培養基中有酵母膏存在時,甘露聚糖肽的最大值代謝量都發生在發酵24～27h之間,即在α-溶血性鏈球菌處于穩定期的時間,這一時間段,此菌的比生長速率也相對偏低(表1),控制了菌體量的過快增長,使甘露聚糖肽維持在較高水平。當酵母膏的添加量在3g/L到7g/L之間時,酵母膏的添加量極大程度上促進了α-溶血性鏈球菌代謝甘露聚糖肽。當酵母膏添加量從7g/L增加到11g/L時,此現象就不明顯,且當酵母膏添加量為7g/L,發酵27h時,甘露聚糖肽最大值代謝量高于酵母膏其它添加量,其代謝量為1.04g/L。所以,7g/L酵母膏添加量是最優酵母膏添加量。

圖4 酵母膏添加量對 α-溶血性鏈球菌代謝曲線的影響Fig.4 Effect of yeast extract on α-hemolytic streptococcus producing mannan peptide curves

3 結論

酵母膏添加量可明顯地影響α-溶血性鏈球菌的生長,發酵培養基中酵母膏添加量越大,對α-溶血性鏈球菌的生長的促進作用越強,α-溶血性鏈球菌的延遲期越短,進入對數期越快。當酵母膏添加量大于7g/L時,這種現象就不再那么明顯。在7g/L的酵母膏添加量下,最大菌落數為1.9×109,最大的比生長速率數值為0.38。

發酵培養基中有酵母膏存在時,甘露聚糖肽的最大值代謝量到來時間從α-溶血性鏈球菌生長的對數期推遲到穩定期,代謝量也相應提高。酵母膏添加量為7g/L時,甘露聚糖肽的代謝量在發酵27h時最大,最大代謝量為1.04g/L。所以,7g/L酵母膏添加量是最優酵母膏添加量。

[1]Suarez D C,Liria C W,Kilikian B V.Effect of yeast extract onEscherichiacoligrowth and acetic acid production[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,1998,14:331-335.

[2]Amrane A,Prigent Y.Influence of yeast extract concentration on batch cultures ofLactobacillushelveticus:growth and production coupling[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,1998,14:529-534.

[3]Pereira D G,Kilikian B V.Effect of yeast extract on growth kinetics ofMonascuspurpureus[J].Applied biochemistry and Biotechnology,2001,91:311-316.

[4]黃云昆,廖力微,趙云,等.下呼吸道標本中α-溶血性鏈球菌的分離和臨床致病性初探[J].臨床檢驗雜志,2003,12(5):273-274.

[5]顏建英,蔣玲玲.溶血性鏈球菌感染與不良妊娠結局[J].中華產科急救電子雜志,2013,2(2):94-100.

[6]劉忠山,王鐵君,吳國民,等.甘露聚糖肽對頭頸部腫瘤患者免疫功能的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(22):4356-4357.

[7]陳志富.甘露聚糖肽膠囊聯合利血生片治療慢性乙型肝炎并白細胞減少癥的臨床觀察[J].吉林醫學,2012,33(8):1622-1623.

[8]郭冬生,彭小蘭,司國立.免疫增強性多抗甲素的作用機理及其研究進展[J].獸藥與飼料添加劑,2003,8(2):15-16.

[9]謝蓉,唐明,李薇,等.甘露聚糖肽對放射治療與化學治療所致白細胞減少癥的療效觀察[J].中國醫藥導刊,2013,15(12):2086-2087.

[10]陳志富,庹田.IV期非小細胞肺癌同步放化療中應用甘露聚糖肽序貫治療的觀察[J].中國醫藥導刊,2013,15(2):293-294,300.

[11]李吉海,李春暉.甘露聚糖肽對口腔粘膜病患者的臨床療效及淋巴細胞活性的影響[J].實用藥物與臨床,2014,17(1):66-68.

[12]Hu Q L,Wang H,Wang Y S,et al.Influences of Polyactin A on activity of human monocytesinvitro[J].ZhongguoYaoli Xuebao,1991,12(6):483-488.

[13]周曉娜.甘露聚糖肽配合捏脊療法治療小兒反復呼吸道感染療效觀察[J].中國現代藥物應用,2012,6(10):82-83.

[14]梁琳琳,楊育芳,孫雪梅,等.B群鏈球菌培養條件的優化研究[J].微生物學免疫學進展,2004,32(3):20-25.

[15]夏帆,高夢祥,廉方,等.甘露聚糖肽產生菌發酵培養基的篩選[J].大眾商務,2009(97):91-92.

[16]馮鎖民,任蘇娟.同時高產甘露聚糖肽和乳酶生的發酵條件研究[J].安徽農業科學,2011,39(19):11889-11891.

[17]陳云華,余清和,李軍,等.甘露聚糖肽及其制備工藝和用途[P].中國專利:03117579.1,2004-10-27.

[18]馬宏偉,李麗,陳爽,等.高純度甘露聚糖肽的制備方法[P].中國專利:200710093102.2,2012-08-22.

[19]周德慶.微生物學教材(第3版)[M].北京:高等教育出版社,2011:4.

Effect of yeast extract on Mannan peptide byα-Hemolyticstreptococcus

XU Cui1,XIONG Qiu1,WU Jia1,GAO Meng-xiang1,2,*

(1.College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;2.Jingchu Food Research and Development Center,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

The effect of amounts of yeast extract in fermentation medium on growth and metabolism of α-hemolyticstreptococcuswere studied. The results showed that:the number of colonies of α-hemolyticstreptococcusincreased obviously with the amount of yeast extract when the amount of yeast extract was from 3g/L to 7g/L,the most number of colonies was 1.9×109,2.5 times as high as the control group 7.6×108. The lag phase of α-hemolyticstreptococcusreduced from 8h to less than 5h. The logarithmic growth rate increased from 2.83 to 11.02. And the stationary phase reduced from more than 27h to 23h. When the yeast extract content was more than 7g/L,those rules were no longer apparent. At the same time,the yeast extract made bacteria volume increase rapidly ahead of time for 2～4h. The largest specific growth rate was 0.38 at fermentation time 4h,and the maximum yield of mannan peptide was 1.04g/L at fermentation time 27h when the yeast extract content was 7g/L.

α-hemolyticstreptococcus;fermentation;yeast extract;mannan peptide

2014-06-13

許翠(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物代謝的物理調控方法。

*通訊作者:高夢祥(1971-)，男，博士，教授，研究方向：主要從事微生物代謝的物理調控方法和農產品保鮮加工方法的研究。

湖北省自然科學基金項目(2013CFB392)。

TS261

A

1002-0306(2015)05-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.030