萵筍多酚氧化酶、過氧化物酶的特性及抑制作用研究

周向軍,楊金龍,路宛如

(天水師范學院生命科學與化學學院,甘肅天水 741001)

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萵筍多酚氧化酶、過氧化物酶的特性及抑制作用研究

周向軍,楊金龍,路宛如

(天水師范學院生命科學與化學學院,甘肅天水 741001)

采用分光光度法測定萵筍多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)的活性,研究酶的穩(wěn)定性、溫度、pH、底物濃度及幾種抑制劑對其活性的影響,建立相應酶促動力學方程,利用正交實驗探討最佳抑制條件。結果表明,PPO和POD最適溫度分別為50℃和40℃,最適pH分別為6.0和6.5,隨溫度不斷升高,PPO和POD活性逐漸下降。動力學方程分別為V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])和V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S])。對PPO抑制強弱為:VC>L-Cys>NaHSO3>檸檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸,對POD抑制強弱為:EDTA>VC>L-Cys>檸檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。正交實驗表明,對PPO最佳抑制條件為:NaHSO39mmol/L、L-Cys 5mmol/L及VC5mmol/L。對POD最佳抑制條件為:VC0.2mmol/L、EDTA 0.2mmol/L及L-Cys 1.4mmol/L。

萵筍,多酚氧化酶,過氧化物酶,特性,抑制

萵筍(Asparagusplettuce)為菊科草本植物,在我國各地普遍栽培。萵筍適合鮮切或速凍等加工,但在加工過程中極易發(fā)生褐變。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和過氧化物酶(peroxidase,POD)是引起果蔬褐變的關鍵酶,當氧氣存在時,前者能催化內源酚氧化生成醌,醌與氨基酸(或蛋白質)作用生成高分子絡合物,從而導致褐色素的生成,色素分子量愈高,顏色愈暗[1-2],后者是H2O2在POD作用下,生成強氧化性的新生態(tài)氧,將酚類化合物氧化,生成各種自由基,隨后通過分子間聚合生成聚合物[3]。果蔬褐變將影響其感官品質、市場和營養(yǎng)價值[4-5]。控制酶促褐變的方法較多,物理法如漂燙,易導致果蔬質地變軟[6],熱處理易影響果汁風味,有一定局限性,因而目前化學法使用較多。王國英[7]研究西葫蘆PPO的特性,并比較了幾種抑制劑的抑制強弱。范騰[8]研究胡蘿卜的POD和苯丙氨酸解氨酶的特性和抑制條件。李曉莉[9]研究幾種抑制劑對山藥PPO的抑制強弱為:L-抗壞血酸>檸檬酸>蘋果酸。孔維寶[10]研究表明,L-cys并不是通過對PPO活性中心的結構性修飾,或是發(fā)生共價結合來抑制其活性,而是直接與其酶促反應產物醌類物質結合生成無色的硫氫化合物,從而抑制褐變的發(fā)生。本實驗研究萵筍 PPO和POD特性,探討了幾種抑制劑對其活性的影響,為深入明確萵筍褐變的機理、控制褐變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮萵筍除去葉和纖維化不可食用部分,低溫儲存;VCsigma產品;L-Cys 國藥集團化學試劑有限公司;NaHSO3天津市凱信化學工業(yè)有限公司;檸檬酸,EDTA 天津德縣化學試劑有限公司;苯甲酸 中國新中化學廠;琥珀酸 化學試劑廠,均為分析純;反應混合液:100mmol/L pH 6.0磷酸緩沖液50mL,愈創(chuàng)木酚28μL,磁力攪拌溶解,加入30%H2O219μL,混勻備用。

722型可見分光光度計 上海欣茂有限公司;PHS-3D雷磁pH計 上海精密科學有限公司;TGL-20M型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶液的制備及活性測定 稱5.0g新鮮萵筍,置于研缽中,加少許石英沙,5.0mL磷酸緩沖液,冰浴研磨成勻漿,4℃,12000r/min離心15min,收集上清液,定至25mL[11]。PPO活性測定:試管中加入50mmol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4.0mL和50mmol/L鄰苯二酚溶液1.0mL,最后加入100μL酶液,立即開始計時,420nm測吸光值。POD活性測定:試管中加入3mL,25mmol/L反應混合液和0.1mL酶液,0.2mL 0.5mol/L H2O2,迅速混合,470nm測定。以吸光值變化表示酶活。定義:吸光值每分鐘變化0.01所需的酶量定義為一個活力單位(U)。

1.2.2 反應進程曲線 在0～15min范圍內,每隔1min,測定PPO吸光值。在0～8min范圍內,每隔30s,測定POD吸光值。以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標,制作反應進程曲線,確定PPO和POD測定時間。

1.2.3 溫度對酶活性的影響和穩(wěn)定性實驗 pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液3.0mL在35、40、45、50、55、60、65℃下保溫10min,加入50mmol/L鄰苯二酚1.0mL,0.1mL酶液,混勻,測定OD420。酶在50、60、70、80、90℃下分別預熱一定時間,探討PPO穩(wěn)定性。反應混合液3.0mL,在35、40、45、50、55、60℃下保溫10min,加入0.5mL酶液,測定OD470。酶在40、50、60、70、80、90℃下分別預熱一定時間,探討POD穩(wěn)定性。

1.2.4 pH對酶活性的影響 pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0乙酸-乙酸鈉緩沖液3.0mL,保溫10min,加入1mL鄰苯二酚溶液和0.1mL酶液,測定OD420,確定PPO最適pH。pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的反應混合液3.0mL,保溫5min,加入0.5mL酶液,搖勻,測定OD470,確定POD最適pH。

1.2.5 不同底物濃度對酶活性的影響 50℃、pH6.0條件下,測定鄰苯二酚分別為0.001、0.002、0.004、0.005、0.008、0.01mol/L時吸光值,制作底物濃度隨時間的變化曲線,并擬合各直線斜率,計算PPO的Vmax和Km[12]。40℃、pH6.5條件下,測定愈創(chuàng)木酚分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012mol/L時吸光值,制作底物濃度隨時間的變化曲線,并擬合各直線,計算POD的Vmax和Km。

1.2.6 不同抑制劑對酶活性的影響 以乙酸-乙酸鈉緩沖液為對照,加入終濃度分別為0、2、4、6、8、10mmol/L的L-Cys、VC、NaHSO3,0、20、40、60、80、100mmol/L的EDTA、檸檬酸、苯甲酸和琥珀酸,測定PPO吸光值,計算相對剩余酶活。0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mmol/L的EDTA、VC,0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol/L的L-Cys,0、4、6、8、10、12mmol/L的NaHSO3,0、40、60、80、100、120mmol/L的檸檬酸、苯甲酸和琥珀酸,測定POD吸光值,計算相對剩余酶活。

相對剩余酶活(%)=測定管酶活性×100/對照管酶活性

1.2.7 正交實驗 根據單因素實驗結果,選擇抑制作用較強的幾種抑制劑進行正交設計,見表1和2。

表1 PPO正交實驗設計Table 1 Orthogonal experiment of PPO

表2 POD正交實驗設計Table 2 Orthogonal experiment of POD

1.3 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 酶促反應進程曲線的確定

由圖1a可知,2min內PPO的反應速率隨時間變化成線性增長,隨后反應速率逐漸降低并趨于平緩。由圖1b可知,3min內POD的反應速率隨時間的變化呈線性增加,隨后曲線趨于平坦,反應速率下降。反應速率隨時間延長降低的原因是底物濃度逐漸下降;產物增加加速了逆反應的進行;隨時間延長酶本身部分失活等,因此,酶活測定應選擇反應初速率,避免上述因素的干擾[13],本實驗PPO和POD測定時間分別2min和3min。

圖1 酶促反應進程曲線Fig.1 Standard curve of enzyme catalysis

注：a：PPO反應進程曲線；b：POD反應進程曲線。

圖2 溫度對酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on enzyme and stabilities注：a,c分別表示溫度對PPO和POD活性的影響； b,d分別表示PPO和POD對溫度的穩(wěn)定性。

2.2 PPO和POD的最適溫度及穩(wěn)定性

PPO吸光值隨溫度的變化見圖2a,在30～50℃范圍內,隨溫度升高,吸光值逐漸增大,50℃時達到最大值,隨后迅速下降,故最適溫度為50℃,這是因為隨溫度增加,底物分子動能增大,反應速率增加,當溫度高于50℃時,隨著溫度增加,蛋白質分子的熱運動增大,導致蛋白變性[14]。由圖2b可知,隨溫度升高,酶活力逐漸下降,90℃時幾乎沒有活性。由圖2c可知,POD最適溫度為40℃,40℃以下時,POD活性隨溫度的升高而逐漸增加,褐變程度加深,當溫度大于50℃時,酶活性迅速下降。由圖2d可知,隨溫度不斷升高,POD活性逐漸下降,80℃時幾乎沒有活性。

2.3 pH對萵筍PPO和POD活性的影響

由圖3a可知,隨pH升高,PPO速率上升,pH6.0時達最大值,故最適pH為6.0,繼續(xù)增大pH,PPO活性迅速下降,這可能與多酚氧化酶的活性部位含有組氨酸基團(pK=6.0)有關[15]。由圖3b可知,pH5.5時出現一個肩峰,這可能是由于反應液中存在同工酶的緣故。過酸或過堿均不利于POD活性。pH大于6.5時,酶活性開始降低,故POD最適pH為6.5。

圖3 pH對酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme注：a,b分別表示pH對PPO和POD活性的影響。

2.4 不同底物濃度對萵筍PPO和POD活性的影響

底物濃度對PPO的影響及其雙倒數作圖見圖4a和圖4b,PPO的Km=0.0059mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(0.0059+[S])。底物濃度對POD的影響及其雙倒數作圖見圖4(c)和(d),求得POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。

圖4 底物濃度對酶活性的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme注：a,b分別表示PPO的v-t曲線和1/V-1/S曲線; c,d分別表示POD的v-t曲線和1/V-1/S曲線。

2.5 不同抑制劑對萵筍PPO和POD活性的影響

各抑制劑對萵筍PPO及POD活性的影響見圖5a～圖5d,IC50計算結果見表3。L-Cys可與反應所產生的醌結合,形成一種穩(wěn)定的無色化合物,同時其結構中的-COOH螯合金屬離子作用很強,可作用于PPO中的Cu2+[16]。VC可作為酶分子中Cu2+的螯合劑,抑制酶促褐變的發(fā)生,另外VC既可作為醌的還原劑,將體系中原有的醌類還原為無色物質,甚至其可被PPO直接氧化,起到競爭性抑制劑的作用[17-18]。NaHSO3與醌不可逆的生成無色產物,與此同時降低了酶作用于一元酚和二羥基酚的活力,同時NaHSO3具有漂白和抑制微生物作用[19]。檸檬酸對PPO的抑制機制是由于檸檬酸分子中的-COOH對PPO中的Cu2+有較強的螯合作用[20]。苯甲酸和琥珀酸主要是提供酸性環(huán)境,使PPO偏離最適pH。EDTA提供堿性環(huán)境,并具有螯合金屬離子的作用[21]。

圖5 不同抑制劑對PPO和POD的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on PPO and POD注：a：L-Cys、VC及NaHSO3對PPO活性的影響; b：檸檬酸、琥珀酸、苯甲酸及EDTA對PPO活性的影響; c：EDTA、VC及L-Cys對POD活性的影響; d：NaHSO3、檸檬酸、苯甲酸及琥珀酸對POD活性的影響。

抑制劑對PPO的IC50(mmol/L)對POD的IC50(mmol/L)VC17740100L-Cys34280700NaHSO350199712檸檬酸217766218EDTA251960064苯甲酸3080248562琥珀酸5407032210

2.6 正交實驗

由表4可知,對PPO抑制的最佳組合為A2B1C1,即NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L,VC5mmol/L,由表5可知,A(NaHSO3)和C(VC)對PPO的抑制達到極顯著(p<0.05),B(L-Cys)的影響不顯著(p>0.05)。最佳條件下重復3次,對PPO抑制率為(35.96±0.88)%。由表6可知,對POD抑制的最佳組合為A1B2C3,即VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L,L-Cys 1.4mmol/L,由表7可知,A(VC)對POD的抑制達到極顯著(p<0.05),B(EDTA)和C(L-Cys)的影響不顯著(p>0.05)。最佳條件下重復3次,對POD抑制率為(34.97±0.31)%。

表4 對PPO抑制的正交結果Table 4 Results of orthogonal experiment for PPO

表5 PPO方差分析Table 5 Analysis of variance for PPO

表6 對POD抑制的正交結果Table 6 Results of orthogonal experiment for POD

表7 POD方差分析Table 7 Analysis of variance for POD

3 結論

萵筍PPO和POD最適溫度分別為50℃和40℃,最適pH為6.0和6.5。隨溫度不斷升高,PPO和POD活性逐漸下降。萵筍PPO的Km=5.9×10-3mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])。POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。對PPO抑制強弱為:VC>L-Cys>NaHSO3>檸檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸。對POD抑制強弱為:EDTA>VC>L-Cys>檸檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。

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Properties and inhibitions of polyphenoloxidase andperoxidase fromAsparagusplettuce

ZHOU Xiang-jun,YANG Jin-long,LU Wan-ru

(College of life science and chemistry,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China)

The activities of polyphenoloxidase(PPO)and peroxidase(POD)fromAsparagusplettucewere determined by spectrophotometer. Enzyme stabilities,the effects of temperature,pH,substrate concentration and several inhibitors on PPO and POD,and their corresponding reaction kinetics equation were studied. Orthogonal experiments were used to optimize inhibition technology. The results showed that the optimum temperature and pH of PPO and POD were 50℃ and 40℃,pH6.0 and pH6.5,respectively. Activities of PPO and POD decreased with increasing temperature. Kinetic equation for PPO and POD were V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])and V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S]),respectively. Inhibition effects were as follows:VC>L-Cys>NaHSO3>citric acid>EDTA>benzoicacid>succinic acid for PPO,EDTA>VC>L-Cys>citric acid>NaHSO3>succinic acid>benzoic acid for POD. Orthogonal experiments showed that the optimum inhibition conditions were as follows:NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L and VC5mmol/L for PPO,VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L and L-Cys 1.4mmol/L for POD,respectively.

Asparagusplettuce;polyphenoloxidase;peroxidase;properties;inhibition

2014-07-08

周向軍(1980-)，男，碩士研究生，講師，研究方向：食品酶學。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.026