羊耳菊藥材中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量測(cè)定

田妍妍，周桂榮，霍志鵬，逄小倩，何 毅，李 萍

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司研究院 現(xiàn)代中藥研究所，天津 300410)

羊耳菊藥材中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量測(cè)定

田妍妍1，2，周桂榮2，霍志鵬2，逄小倩2，何 毅2，李 萍1△

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司研究院 現(xiàn)代中藥研究所，天津 300410)

目的 建立羊耳菊藥材中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的HPLC含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量控制和運(yùn)用提供依據(jù)。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸水(17∶83)為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min。結(jié)果 測(cè)定了20批不同產(chǎn)地的羊耳菊藥材，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量在0.12%～0.65%之間。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于羊耳菊藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

羊耳菊；3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.)DC為菊科Compositae旋覆花屬InulaL植物，亞灌木，主要分布于我國(guó)四川、云南、貴州、廣西、廣東、江西、湖南、福建、浙江等地，全草或根可供藥用，有除痰定喘、疏風(fēng)散寒、解毒消腫、活血調(diào)經(jīng)及治跌打損傷等作用[1]，可用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，風(fēng)濕疼痛等[2]。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道分離的羊耳菊化學(xué)成分已有100余種，主要包括萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油類等類型[3-6]。3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等諸多藥理作用[7]，本研究采用HPLC法測(cè)定了羊耳菊藥材中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，以期為羊耳菊藥材的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 waters 2695系列高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司)，Milli-Q型超純水系列(美國(guó)Millipore 公司)，XS-205DU型1/10萬(wàn)分析天平(瑞士梅勒特-托利多公司)

1.2 試藥 乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)，乙醇(分析純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，水為自制超純水。3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品(批號(hào)111782-201204，純度94.2%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，20批羊耳菊藥材于2013年-2015年采集于云南，廣東，廣西，貴州四省(表1)，并經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)李萍教授鑒定為植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.)DC的新鮮或干燥全草。

表1 羊耳菊藥材產(chǎn)地、部位、采收時(shí)間明細(xì)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈：0.1%磷酸水(17：83)，流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品11.78 mg置50 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.2219 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取羊耳菊粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g，置60 mL索氏提取器中，加入120 mL甲醇，加熱回流4 h，提取液濃縮至約10 mL，放冷，移入25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，5000 r/min，20 ℃下離心10 min，吸取上清液，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，吸取3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品溶液，供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。理論板數(shù)按3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰計(jì)≥5000，供試品色譜圖中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的保留時(shí)間與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間一致，與其他組分峰的分離度大于1.5。

A.對(duì)照品；B.供試品；1.3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5，1，2.5，5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，將5個(gè)不同濃度級(jí)別的對(duì)照品按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果表明，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸進(jìn)樣量在0.1110 μg-2.219 μg與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3949931X-28863，R2=0.9999。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取6號(hào)羊耳菊樣品粉末約1.0 g，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD值為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取6號(hào)羊耳菊樣品粉末約1.0 g，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD值為1.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6號(hào)羊耳菊樣品粉末6份，各約1.0 g，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得6份平行樣品中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量的RSD值為0.46%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取6號(hào)羊耳菊樣品粉末(重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量為0.1661%)6份，各約0.5 g，分別加入2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液4 mL，并按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸加樣回收率

2.9 樣品測(cè)定 取各產(chǎn)地羊耳菊樣品粉末，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算不同產(chǎn)地羊耳菊樣品中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的百分含量，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的百分含量

3 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)分別考察了加熱回流、超聲提取、索氏提取三種提取方式，二純水、甲醇、乙醇3種提取溶劑，2、3、4 h 3種提取時(shí)間的提取效率，結(jié)果表明以甲醇為提取溶劑，經(jīng)索氏提取4 h后3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量最高。

預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水，乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，從分離情況和出峰時(shí)間等綜合分析，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液以17：83等度洗脫，分離度較好，峰形對(duì)稱且保留時(shí)間適中。

通過(guò)紫外光譜掃描，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸甲醇溶液在329 nm處有最大吸收，因此選擇329nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量進(jìn)行比較，20批不同產(chǎn)地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量在0.12%～0.65%之間，這種含量差異可能與羊耳菊產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境，采收時(shí)間等因素有關(guān)。如果要更加全面的考察不同產(chǎn)地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，仍需要采集更多，更具代表性的樣品進(jìn)行深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸進(jìn)行含量測(cè)定，具有快速，準(zhǔn)確，靈敏度高的特點(diǎn)，為羊耳菊的深入研究與開發(fā)提供了參考，也為羊耳菊質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

[1]中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1979，75：271.

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：176.

[3]胡琳，賀正山.羊耳菊化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(10)：889-894.

[4]楊雁，王于方，趙雷，等.羊耳菊花的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2011，42(6)：1083-1086.

[5]謝紅剛，張宏武，張江，等.羊耳菊的化學(xué)成分[J].中國(guó)天然藥物，2007，5(3)：193-196.

[6]郭啟雷，楊峻山.羊耳菊的化學(xué)成分研究(Ⅱ)[J].中藥材，2007，30(1)：35-37.

[7]李祖晟，朱志安.二咖啡酰奎寧酸藥理實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2004，10(4)：249-251.

田妍妍(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：生藥活性成分與質(zhì)量評(píng)價(jià)，E-mail：TianYansq@163.com

△通信作者：李萍，Tel：025-85391244，E-mail：liping2004@126.com

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