番茄黃化曲葉病毒在湖北首次報道

湯亞飛，何自福＊，杜振國，佘小漫，藍國兵，羅方芳

（1.廣東省農業科學院植物保護研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640）

番茄黃化曲葉病是世界范圍內嚴重影響番茄生產的一種重要病害，已給熱帶和亞熱帶地區的番茄生產造成嚴重損失［1］。田間番茄染病后表現為植株矮化，葉片黃化、變小，葉片邊緣向上卷曲。生長發育早期染病時，植株無法正常開花結果；后期染病，植株上部新葉表現癥狀，結果量減少，果實變小，失去市場價值。

番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurl virus，TYLCV）是引起全球各地番茄黃化曲葉病的主要病原之一。該病毒屬雙生病毒科（Geminiviri-dae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員，其基因組僅含A 組分（DNA-A），為單鏈環狀；該病毒由煙粉虱以持久方式傳播，同時可經嫁接傳播，不能經機械摩擦或種子傳毒；其寄主有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆、煙草等［2］。TYLCV 最先在以色列發現，之后隨著煙粉虱在全球范圍暴發而蔓延至中東、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亞洲等多個國家和地區［3］。2006年，該病毒傳入我國上海［4］，之后在浙江、江蘇、安徽、山東、河北、天津及北京等多個省市發生，造成嚴重損失［5-15］。2014年春季，湖北省武漢市田間番茄病株表現出嚴重的黃化、曲葉癥狀，疑似感染了雙生病毒。為了明確引起湖北省武漢市番茄黃化曲葉病的病原種類，筆者對6份病樣進行了病原分子鑒定，對代表分離物的全基因組進行了克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

6份疑似番茄黃化曲葉病的病葉片（編號分別為HB01～06）采自湖北省武漢市一個試驗大棚，病株表現為植株矮縮，葉片皺縮、葉緣黃化；3 份陽性樣品為本實驗室通過農桿菌介導TYLCV 侵染性克隆注射接種發病的番茄葉片；2 份陰性樣品為本實驗室保存的健康番茄葉片。

1.2 供試番茄樣品總DNA 提取

利用CTAB方法［16］提取各供試番茄葉片組織的總DNA。

1.3 PCR 檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV 494／CoPR［17-18］，對11份供試樣品進行PCR檢測。

1.4 RCA擴增及酶切分析

隨機挑取PCR 檢測為陽性的病樣HB01 和HB02總DNA，分別取1.0μL 為模板，利用TempliPhiTMRCA Kit（GE Healthcare）進行滾環擴增（rolling circle amplification，RCA），以獲得病毒的全基因組。具體方法按照試劑盒說明書上的步驟進行。

RCA 反應結束后，擴增產物分別用BamH I、Hind Ⅲ、PstI限制性內切酶進行酶切。酶切反應體系為：RCA 產物2μL、內切酶1μL、10×內切酶緩沖液1μL，總酶切反應體系為10μL。在37 ℃條件下酶切2h以上，然后進行電泳分析。若某個內切酶的酶切產物為2.5～3.0kb，或同時還產生1.3 kb左右的條帶，則克隆這些特異性條帶。

1.5 序列分析

利用DNAStar 軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）進行序列拼接，利用BLAST 程序進行序列相似性搜索，進一步用DNAStar的MegAlign進行序列比較分析，進化樹構建采用MEGA 5.05 的鄰接法（neighbor joining，NJ）。

2 結果與分析

2.1 PCR 檢測結果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR 進行PCR 檢測，從6份表現黃化、曲葉癥狀的番茄病樣（編號分別為HB01～06）總DNA 中均擴增到1條與陽性對照大小一致的特異片段，長度為570bp，而健康植株樣品總DNA 中未擴增出任何片段（見圖1）。表明6份樣品中均含有菜豆金色花葉病毒屬病毒。

圖1 番茄樣品PCR 檢測結果Fig.1 PCR detection result of tomato samples

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

選取病樣HB01 和HB02 的總DNA 分別進行RCA 和酶切反應，結果顯示，其RCA 產物均能被BamH I切出1條約2.7kb大小的單一條帶。克隆和序列測定結果表明，這2 個片段序列全長均為2 781nt，且兩者的序列同源率為99.8%，即為病毒分離物DNA-A的全基因組。以HB01的全長序列代表該病毒分離物基因組，其GenBank登錄號為KJ850344。

病毒分離物HB01的基因組全長序列具有單組分菜豆金色花葉病毒屬成員基因組DNA-A 的典型特征，為單鏈閉合環狀，推導編碼6個ORFs。基因組病毒鏈含AV1基因（308～1 084nt，編碼CP）和AV2基因（148～498nt，編碼與病毒移動相關蛋白），互補鏈含有AC1基因（1 542～2 615nt，編碼復制酶）、AC2基因（1 226～1 633nt，轉錄激活蛋白）和AC3基因（1 081～1 485nt，編碼復制增強蛋白）和AC4基因（2 171～2 464nt）。在AV2與AC1之間有一個313nt的非編碼區（位于2 616～147nt），其中含有與雙生病毒復制起始有關的保守序列TAATATTAC［19］（位于2 775～2nt）。

BLAST結果顯示，與HB01DNA-A 序列有較高同源性的序列均為TYLCV 分離物DNA-A。進一步比較結果顯示，HB01DNA-A與來自中國不同地區的TYLCV分離物的同源性均在97%以上，其中與來自上海（TYLCV-SH2，AM282874）、浙江（TYLCV-ZJ3，AM698117）和安徽（TYLCV-AH-HB1，FN650807）3個分離物DNA-A的同源性最高，均為99.4%。

為了分析病毒分離物HB01與已報道的各TYL-CV 分離物的親緣關系，本文選取了來自我國不同地區的12 個分離物以及國外不同國家來源的19 個TYLCV 代表分離物，以我國臺灣番茄曲葉病毒白沙分離物（TomatoleafcurlTaiwanvirus，ToLCTWV，DQ237918）為外組構建系統進化樹。從該系統進化樹（圖1）可以看出，HB01與來自中國不同地區的12個分離物及國外的11個分離物親緣關系較近，聚在一個分支，進一步與來自科威特的KISR分離物形成一個大的分支；而與日本Mild［Tokai］分離物、西班牙Mild［Spain7297］分離物、留尼汪島分離物、日本Sz分離物、阿巴代分離物、伊朗分離物及阿曼Tom-48分離物等7個分離物的親緣關系相對較遠。

圖2 HB01與其他31個TYLCV分離物的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HB01and 31isolates of TYLCV

3 討論

雖然番茄黃化曲葉病已在我國上海、浙江、江蘇、安徽、山東、河北、河南、天津、北京、吉林、陜西、廣東、廣西、福建、海南、云南、新疆、寧夏、重慶、遼寧、甘肅、四川等20多個省（市、自治區）相繼發生，但對于湖北來說還是一個新病害。本文應用RCA 方法從來自湖北的番茄病樣中擴增獲得病毒分離物HB01的全基因組序列，該序列與國際上已報道的TYLCV各分離物同源性均在89%以上，其中與來自我國其他地區的TYLCV 分離物的同源率均在97%以上。因此，根據目前國際雙生病毒分類方案［2］，確定侵染湖北番茄的病毒分離物HB01屬于TYLCV的一個分離物，這是首次在湖北省檢測到該病毒。

自2006年Wu等［4］首次報道TYLCV入侵我國以來，該病毒已擴散到我國20多個省（市、自治區），并造成嚴重損失。本研究通過比較病毒分離物基因組序列發現，我國各地分離物的同源性在97%以上。這說明：雖然該病毒入侵我國將近10年，但其種群的遺傳依然比較穩定。當然，由于該病毒在田間與其他雙生病毒存在復合侵染［20］，TYLCV是否會與其他病毒進行重組產生新株系或新病毒，還需要進一步監測。

近年來，湖北番茄栽培面積呈擴大趨勢，尤其是高山番茄，市場效益好，發展迅速，面積逐年擴大，現已成為湖北省高山蔬菜高效栽培的主要品種之一。本研究首次在湖北番茄上發現番茄黃化曲葉病疫情，說明該病毒也開始入侵到湖北省，應引起有關部門和生產者的重視。積極采取有效的防范措施，預防與控制該病在湖北省傳播、擴散和流行。

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