黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱的毒力

杜廣祖，楊衛(wèi)秋，周躍能，2，和淑琪，陳 斌＊，桂富榮，李正躍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司，農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)研究國(guó)家工程中心，昆明 650201；2.云南省河口縣植檢植保站，河口 661300）

灰飛虱［Laodelphaxstriatellus（Fallén）］屬半翅目飛虱科，是水稻上的一種重要害蟲(chóng)，主要為害早、中稻秧田和本田分蘗期的稻苗［1］。國(guó)外主要分布于從菲律賓至西伯利亞一帶的亞洲稻區(qū)和歐洲的溫帶地區(qū)［2］，國(guó)內(nèi)則幾乎遍及各稻區(qū)。除以成蟲(chóng)、若蟲(chóng)刺吸為害水稻、小麥外，還傳播水稻條紋葉枯病（Rice stripevirus，RSV）、水稻黑條矮縮病（Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV）、小麥叢矮病（Northern cerealmosaicvirus，NCMV）等多種植物病毒病［3-4］，且其傳毒危害造成的損失遠(yuǎn)大于刺吸危害［5-6］。

綠僵菌作為重要的昆蟲(chóng)病原真菌種類，寄主廣泛，對(duì)人畜及環(huán)境安全，是國(guó)內(nèi)外害蟲(chóng)生防真菌研究中備受關(guān)注的蟲(chóng)生真菌種類之一［7］，已廣泛用于蝗蟲(chóng)的防治實(shí)踐［8-10］，也有發(fā)現(xiàn)在田間感染褐飛虱［11］。溫度是影響蟲(chóng)生真菌生長(zhǎng)發(fā)育與孢子萌發(fā)的重要因素之一，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響其毒力［12］。目前關(guān)于黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的毒力測(cè)定已有一些研究報(bào)道［13-15］，但有關(guān)綠僵菌對(duì)灰飛虱毒力研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究針對(duì)云南省本地灰飛虱發(fā)生為害嚴(yán)重的現(xiàn)狀，生物測(cè)定黃綠綠僵菌在不同溫度下對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)及若蟲(chóng)的室內(nèi)毒力，以期篩選灰飛虱生防黃綠綠僵菌菌株及其侵染適宜溫度條件，從而為灰飛虱生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃綠綠僵菌（M.flavoviride）菌株KM1104分離自昆明水稻田的褐飛虱罹病蟲(chóng)體；采用SDAY 培養(yǎng)基分離純化后4℃保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)病原體實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

供試?yán)ハx(chóng)：室內(nèi)采用張愛(ài)民等［16］的方法在人工氣候室內(nèi)用‘楚粳29’水稻苗飼養(yǎng)繁殖10代，獲得齡期一致的灰飛虱健康種群。

菌株培養(yǎng)：將供試菌株分別在光照培養(yǎng)箱25 ℃，L∥D＝16h∥8h條件下，SDAY培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)采集分離獲得的菌株，4℃保存于昆蟲(chóng)病原體實(shí)驗(yàn)室備用。

毒力測(cè)定：在SDAY 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待孢子粉布滿全皿后，刮取分生孢子粉移入20mL含0.05%Tween-80濕潤(rùn)劑的無(wú)菌水中，置混勻器上充分振蕩，然后按比例依次稀釋配制1.01×108、1.01×107、1.01×106、1.01×105、1.01×104、1.01×103孢子／mL濃度的孢子懸浮液，以含0.05% Tween-80的無(wú)菌水為對(duì)照。選取齡期一致的灰飛虱3 齡若蟲(chóng)或成蟲(chóng)，采用浸漬法［17］接種，每次選取30頭供試灰飛虱蟲(chóng)體置于200目尼龍紗網(wǎng)袋中再浸入相應(yīng)濃度的孢子懸浮液2s，然后迅速取出，用滅過(guò)菌的干濾紙吸去蟲(chóng)體表面殘留的懸浮液，分別放置于24、27、30 ℃，光周期L∥D ＝12h∥12h，濕度80%±5%的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每天定時(shí)觀察記載死亡蟲(chóng)量，并將死亡蟲(chóng)體在25℃和L∥D＝12h∥12h條件下保濕培養(yǎng)，鑒定死亡原因，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用TDM 模型（時(shí)間-劑量-死亡率模型）處理生物測(cè)定數(shù)據(jù)，采用Duncan檢驗(yàn)分析各數(shù)據(jù)的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)分析采用DPS軟件［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種黃綠綠僵菌KM1104后灰飛虱的累積死亡率

2.1.1 灰飛虱成蟲(chóng)的累積死亡率

從圖1（左）可以看出，在24～30 ℃下，黃綠綠僵菌KM1104菌株對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)具有一定的侵染致病能力，用孢子懸浮液接種灰飛虱成蟲(chóng)后，累積死亡率隨接種濃度的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，不同濃度及溫度下累積死亡率差異明顯。在24、27和30 ℃下，用1.01×103～1.01×108孢子／mL 綠僵菌孢子懸浮液接種灰飛虱成蟲(chóng)后，第4天時(shí)的累積死亡率分別為11.11%～35.56%、14.44%～28.89%和17.78%～53.33%，表明在30 ℃下灰飛虱成蟲(chóng)的累積死亡率高于24 ℃（F＝21.32，P＜0.01）和27 ℃（F＝19.45，P＜0.01），但24 ℃和27 ℃下的累積死亡率間無(wú)明顯差異（F＝3.47，P＞0.015）。到接種后第12 天時(shí)，于24、27 和30 ℃下接種了1.01×103～1.01×108孢子／mL 的灰飛虱成蟲(chóng)的累積死亡率分別為26.67%～90.00%、34.44%～94.44%和52.22%～100%。24 和27 ℃下用低濃度1.01×103孢子／mL 接種后，灰飛虱成蟲(chóng)的累積死亡率均低于50%，而在30 ℃下用1.01×103孢子／mL接種后灰飛虱成蟲(chóng)的累積死亡率達(dá)50%以上，明顯高于24 ℃（F＝31.45，P＜0.01）和27 ℃（F＝23.39，P＜0.01）下的死亡率。

2.1.2 灰飛虱若蟲(chóng)的累積死亡率

從接種處理后灰飛虱若蟲(chóng)的累積死亡率（圖1：右）可以看出，在24～30 ℃下，黃綠綠僵菌對(duì)灰飛虱3齡若蟲(chóng)均具有致病力，其中27 ℃和30 ℃下致病力較強(qiáng)，用濃度為1.01×103～1.01×108孢子／mL孢子懸浮液接種后第4 天時(shí)，累積死亡率分別為8.89%～24.44%和10.00%～30.00%，而到第12天時(shí)累積死亡率均達(dá)50%以上，分別為51.11%～100%和61.11%～100%。在24 ℃下，用濃度為1.01×103～1.01×108孢子／mL 綠僵菌孢子懸浮液接種3齡若蟲(chóng)后第4天時(shí)累積死亡率僅為5.56%～20.00%，低于27 ℃和30 ℃下的累積死亡率（27 ℃：F＝9.32，P＜0.05；30 ℃：F＝11.15，P＜0.05），用1.01×108孢子／mL 濃度接種后第12天時(shí)累積死亡率達(dá)72.22%，仍明顯低于30 ℃下的累積死亡率（F＝37.28，P＜0.01）。

圖1 不同溫度下黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱的累積死亡率Fig.1 The cumulative mortality of Laodelphax striatellus after infection by Metarhizium flavoviride at different temperatures

2.2 黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和若蟲(chóng)的致死中濃度LC50

從表1 可以看出，不同溫度下黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)侵染致病的致死中濃度不同，其中30 ℃下對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的致死中濃度LC50明顯低于24和27 ℃下的LC50（24 ℃：成蟲(chóng)F＝21.31，P＜0.05；若蟲(chóng)F＝25.45，P＜0.05；27 ℃：成蟲(chóng)F＝15.27，P＜0.05；若蟲(chóng)F＝19.37，P＜0.05）。24℃時(shí)，黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的LC50分別為7.14×104孢子／mL和3.69×105孢子／mL，與27 ℃下成蟲(chóng)和若蟲(chóng)的LC50間無(wú)明顯差異（成蟲(chóng)：F＝2.24，P＞0.05；若蟲(chóng)：F＝1.19，P＞0.05），但顯著大于30 ℃下對(duì)成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的LC50（成蟲(chóng)：F＝15.34，P＜0.05；若蟲(chóng)：F＝16.41，P＜0.05），因而在24 ℃下的致病力低于27 ℃和30 ℃下的致病力。

此外，從表1還可看出，在24～30 ℃下，黃綠綠僵菌KM1104 菌株對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)的致死中濃度LC50均小于對(duì)3齡若蟲(chóng)的LC50，表明對(duì)成蟲(chóng)的致病力強(qiáng)于若蟲(chóng)。如在27 ℃時(shí)，對(duì)成蟲(chóng)的LC50為1.33×104孢子／mL，顯著低于對(duì)3 齡若蟲(chóng)的LC50值1.05×105孢子／mL（F＝36.43，P＜0.01）；同樣，在30 ℃時(shí)對(duì)成蟲(chóng)的LC50小于對(duì)3齡若蟲(chóng)的LC50（F＝29.27，P＜0.01）。

表1 不同溫度下黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱的毒力1）Table1 Virulence of Metarhizium flavoviride to Laodelphax striatellus at different temperatures

綜合以上結(jié)果，黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)的致病力高于對(duì)3齡若蟲(chóng)的致病力，不同溫度下的致病力大小順序?yàn)?0 ℃＞27 ℃＞24 ℃，對(duì)成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的LC50分別為1.45×103～7.14×104和7.25×103～3.69×105孢子／mL。

2.3 黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱的致死中時(shí)LT50

黃綠綠僵菌菌株KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的侵染致死中時(shí)LT50不同（表2）。用較低濃度黃綠綠僵菌菌株1.01×105和1.01×106孢子／mL于24、27和30 ℃下接種處理灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的LT50分別為5.13～11.53和8.49～11.58d，總體表現(xiàn)為在該濃度下黃綠綠僵菌更易于侵染灰飛虱成蟲(chóng)（F＝18.35，P＜0.01）。當(dāng)用較高濃度的1.01×107和1.01×108孢子／mL 接種后對(duì)成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的LT50分別為3.02～7.01d 和6.85～10.05d，即表現(xiàn)對(duì)成蟲(chóng)的致病速度明顯快于若蟲(chóng)。綜上所述，供試黃綠綠僵菌KM1104菌株對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)的侵染致病速度比若蟲(chóng)快。

不同溫度下黃綠綠僵菌KM1104菌株對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的侵染致死中時(shí)LT50不同（表2），24和27 ℃下較高接種濃度對(duì)成蟲(chóng)的LT50間無(wú)明顯差異，30 ℃下對(duì)成蟲(chóng)的LT50明顯小于對(duì)3齡若蟲(chóng)的LT50值，因此在30 ℃下，該菌株對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)的侵染致病力強(qiáng)于3 齡若蟲(chóng)，接種1.01×105～1.01×108孢子／mL 后對(duì)成蟲(chóng)和3 齡若蟲(chóng)的LT50分別為3.02～6.86d和6.85～9.35d。

3 討論

黃綠綠僵菌作為一種傳統(tǒng)的蟲(chóng)生真菌，一直是害蟲(chóng)生防真菌篩選和開(kāi)發(fā)研究的重要種類之一［7，19］，不同菌株的生長(zhǎng)溫度范圍不同，如黃綠綠僵菌菌株SM076能在20～29 ℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育，其最適生長(zhǎng)發(fā)育溫度為26 ℃［20］。本研究發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌KM1104 菌株在24、27 和30 ℃下對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)均具有一定的致病作用，但在27 ℃和30 ℃下的致病力高于24 ℃，這也與灰飛虱最適生長(zhǎng)、繁殖的溫度范圍一致［1-21］，因而該菌株KM1104是一株對(duì)灰飛虱具有良好生防潛力的菌株。然而耿博聞研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃條件下黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)的侵染致死率較高［22］，造成這種差異的原因可能與菌株來(lái)源和昆蟲(chóng)種類不同有關(guān)。

表2 不同溫度下黃綠綠僵菌對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)及3齡若蟲(chóng)的致死中時(shí)LT501）Table 2 The median lethal time（LT50）of Metarhizium flavoviride to adults and 3rd instar nymph of Laodelphax striatellus at different temperatures

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌菌株KM1104對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)及3齡若蟲(chóng)均有致病力，但對(duì)成蟲(chóng)的致病力高于3齡若蟲(chóng)，30 ℃時(shí)，接種濃度為1.01×108孢子／mL時(shí)對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)的致死中時(shí)LT50（3.02d）顯著低于3齡若蟲(chóng)（6.85d），表明灰飛虱成蟲(chóng)對(duì)黃綠綠僵菌的敏感性高于3齡若蟲(chóng)，該結(jié)果與李茂業(yè)等報(bào)道的黃綠綠僵菌Mf82菌株對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)的致病性高于5 齡若蟲(chóng)的結(jié)果一致［14］。由于黃綠綠僵菌主要在體表以芽管或產(chǎn)生附著胞侵染褐飛虱［13］，若蟲(chóng)蛻皮會(huì)影響到分生孢子在體表的附著，這也是造成若蟲(chóng)死亡率低于成蟲(chóng)的原因之一。

黃綠綠僵菌對(duì)昆蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病性而對(duì)其他節(jié)肢動(dòng)物無(wú)害［23］，已廣泛用于害蟲(chóng)生防制劑的開(kāi)發(fā)，本研究中的菌株分離自罹病褐飛虱成蟲(chóng)，說(shuō)明該菌株在自然條件下可以感染褐飛虱成蟲(chóng)；同時(shí)研究表明對(duì)灰飛虱成蟲(chóng)及3 齡若蟲(chóng)均存在一定的致病力。因此，當(dāng)田間2種稻飛虱共同存在時(shí)，施用綠僵菌制劑則可對(duì)兩種稻飛虱都起到良好的控制作用，因而黃綠綠僵菌KM1104可用于稻飛虱生防制劑的開(kāi)發(fā)。

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