基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌

趙玉強(qiáng)，田艷麗，羅金燕，姚紅梅，余 慧，陳 磊，胡白石＊

（1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

瓜類細(xì)菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細(xì)菌病害，由西瓜嗜酸菌（Acidovoraxcitrulli）引起［1-2］。該病為典型的種傳病害，其病原菌可侵染葉片、果實(shí)和種子，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)瓜類生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了極大的威脅［3］。瓜類細(xì)菌性果斑病自20世紀(jì)90 年代在我國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，在新疆、海南、內(nèi)蒙古、寧夏、北京、河北、山東、吉林、福建、湖南等地相繼發(fā)生，并呈上升趨勢(shì)，造成大田西瓜和甜瓜減產(chǎn)甚至絕收，給西甜瓜生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失［4-9］。在病害發(fā)病初期快速、準(zhǔn)確鑒定出BFB，及時(shí)實(shí)施有效的藥劑防控措施，對(duì)防治該病害的擴(kuò)散和蔓延尤為重要。因此，建立西瓜嗜酸菌的快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)是防止該病害發(fā)生的重要舉措。

目前檢測(cè)西瓜嗜酸菌的主要方法有：傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離方法［10］、Biolog鑒定方法［11］、血清學(xué)檢測(cè)方法［12］和分子生物學(xué)方法［13-16］，但這些診斷方法存在診斷過程繁瑣、周期長(zhǎng)、成本高、靈敏度不高或特異性不強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)還需要昂貴的儀器和試劑等。2000年Notomi等人［17］報(bào)道了一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），該方法根據(jù)目的基因及其特點(diǎn)，針對(duì)靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶（BstDNA polymerase），在等溫條件下（60～65 ℃）保溫30～60min，即可實(shí)現(xiàn)核酸的大量擴(kuò)增，并且伴有肉眼可見的副產(chǎn)物白色焦磷酸酶沉淀產(chǎn)生［17］。該檢測(cè)方法具有特異性好、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作方便和不需要昂貴的儀器等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌等領(lǐng)域的檢測(cè)中［18-21］。

本試驗(yàn)根據(jù)A.citrulli基因組中Aave＿4063和Aave＿4064序列的特點(diǎn)，基于LAMP技術(shù)建立了瓜類細(xì)菌性果斑病菌的快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)體系，并將其應(yīng)用于市售的瓜種子實(shí)際樣品檢測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 材料

BstDNA 聚合酶購(gòu)自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜堿、MgSO4、鈣黃綠素（calcein）購(gòu)自Sigma公司；dNTPs、DL100marker等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Loopamp 反應(yīng)管購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；移液管購(gòu)自AXYGEN 公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根細(xì)菌基因組DNA 小量制備試劑盒）購(gòu)自天根（北京）公司。供試菌株寄主、來(lái)源及數(shù)量見2.2小節(jié)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Aave＿4063和Aave＿4064序列，應(yīng)用Bioedit軟件進(jìn)行序列分析，并使用PrimerExplore v 4軟件，依據(jù)LAMP引物的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)LAMP引物。探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，用ddH2O 溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LAMP反應(yīng)體系的建立

LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系為25μL，包括2.5μL 10×ThermoPol［200mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L KCl，100mmol／L（NH4）2SO4，2 mmol／L MgSO4，0.1% Trition X-100，pH 8.8］、8mmol／L MgSO4、0.8 mol／L 甜菜堿、500μmol／L each dNTP、0.4 μmol／L外引物Ac-F3 和Ac-B3、1.6μmol／L 的內(nèi)引物Ac-FIP 和Ac-BIP、1μLBstDNA 聚合酶（8 U／μL）、1μL 0.02 mmol／L 鈣黃綠素染料，1μL DNA 模板或菌懸液，加ddH2O 補(bǔ)至25μL。將反應(yīng)管置于水浴鍋65 ℃恒溫反應(yīng)60min，然后80 ℃加熱5min使酶失活終止反應(yīng)。

1.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物判斷方法

LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可通過肉眼觀察渾濁度的變化來(lái)判斷，也可通過加入熒光染料觀察顏色變化來(lái)判斷。本試驗(yàn)在反應(yīng)前加入1μL 0.02mmol／L 的鈣黃綠素染料，產(chǎn)生擴(kuò)增的反應(yīng)管顏色由橙色變?yōu)榱辆G色，未產(chǎn)生擴(kuò)增的則仍保持橙色不變，陰性對(duì)照也為橙色。

1.5 LAMP特異性檢測(cè)

按照天根細(xì)菌基因組DNA 小量制備試劑盒說(shuō)明書，分別提取供試菌株的基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，鑒定LAMP反應(yīng)的特異性。

1.6 LAMP靈敏度檢測(cè)

果斑病菌菌株xjl12的基因組DNA模板經(jīng)測(cè)定濃度后，按10倍梯度稀釋為2.0×106～2.0×100cfu／mL。分別取1μL作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)模板，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，鑒別是否發(fā)生了LAMP擴(kuò)增，確定LAMP的靈敏度，并與常規(guī)PCR［22］的靈敏度進(jìn)行比較。

1.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取6種市售種子進(jìn)行檢測(cè)。每份種子取300粒，剖開后，加50mL 無(wú)菌水室溫浸泡4h，將浸出液6 000r／min離心3min，棄上清。加入2mL 無(wú)菌水重新懸浮沉淀，取0.5 mL 懸浮液用于分離培養(yǎng)，剩余的1.5mL懸浮液利用天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取DNA，取1μL DNA 作為L(zhǎng)AMP 檢測(cè)的模板。

在進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，所有的樣品均利用果斑病菌半選擇性培養(yǎng)基TWZ（0.5% 蛋白胨，0.025%CaCl2，1%吐溫-80，50 mg／L 小檗堿，50 mg／L放線菌酮，50mg／L TTC）進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃，24～48h，用以驗(yàn)證LAMP檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)的特異性引物

本試驗(yàn)所選取的靶標(biāo)基因?yàn)锳ave＿4063和Aave＿4064，基因序列信息均來(lái)自于GenBank（登錄號(hào)為NC＿008752：4516230～4516461）。筆者將缺失的Aave＿4063和Aave＿4064 基因中的一段（區(qū)域：4516230-4516461）核酸序列在NCBI 中進(jìn)行BLASTn 和tBLASTx 搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有任何已知序列與其相同。本研究根據(jù)Aave＿4063和Aave＿4064基因序列設(shè)計(jì)了1 套果斑病菌LAMP檢測(cè)的特異性引物（表1）。其中Ac-F3／Ac-B3為外引物，Ac-FIP／Ac-BIP為內(nèi)引物。

2.2 LAMP檢測(cè)方法的特異性

以本研究設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)果斑病菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以水作為陰性對(duì)照，并用其他嗜酸菌屬菌懸液作為病原菌對(duì)照檢測(cè)LAMP 反應(yīng)的特異性。結(jié)果如圖1所示，果斑病菌反應(yīng)管呈亮綠色，為陽(yáng)性，其他嗜酸菌和陰性對(duì)照均為黃綠色，為陰性。同樣的，利用本試驗(yàn)所建立的LAMP 體系，其他參試菌株也均為陰性（表2）。

表1 LAMP引物序列Table 1 The primers used for loop-mediated isothermal amplification

圖1 LAMP反應(yīng)的特異性Fig.1 Specificity of LAMP detection

表2 供試細(xì)菌菌株LAMP結(jié)果1）Table 2 LAMP results of tested strains

2.3 LAMP檢測(cè)方法的靈敏度

將10倍梯度稀釋的果斑病菌懸液進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果如圖2～3所示，檢測(cè)結(jié)果的最低檢測(cè)靈敏度為2.0×101cfu／mL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高100倍。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

利用本試驗(yàn)建立的瓜類細(xì)菌性果斑病菌LAMP檢測(cè)體系，對(duì)市售的西、甜瓜種子進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖4 所示：1～5 反應(yīng)管呈亮綠色，為陽(yáng)性，6～7反應(yīng)管呈現(xiàn)黃綠色，為陰性，且所有LAMP檢測(cè)結(jié)果與半選擇性培養(yǎng)基結(jié)果一致（結(jié)果未列出）。結(jié)果表明本研究所建立的檢測(cè)方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖2 LAMP反應(yīng)的靈敏度Fig.2 Sensitivity of LAMP method using serially diluted Acidovorax citrulli as template

圖3 常規(guī)PCR 檢測(cè)的靈敏度Fig.3 Sensitivity of conventional PCR using serially diluted Acidovorax citrulli as template

圖4 利用LAMP體系從西、甜瓜種子中檢測(cè)西瓜嗜酸菌Fig.4 Detection of Acidovorax citrulli in cantaloupe and watermelon seed samples using LAMP

3 討論

西瓜嗜酸菌引起的瓜類細(xì)菌性果斑病為種傳病害，種子帶菌是其發(fā)生的主要原因［23］。近期研究表明，在溫室育苗的條件下，單粒種子僅攜帶10cfu的西瓜嗜酸菌就可以導(dǎo)致瓜類細(xì)菌性果斑病的大面積發(fā)生和流行［24］。至今對(duì)該病害還沒有有效的防治措施，加強(qiáng)檢疫，控制其傳播擴(kuò)散是預(yù)防此病害最有效的措施。目前，WFB1／WFB2是西瓜嗜酸菌PCR檢測(cè)常用的引物之一，由于西瓜嗜酸菌與燕麥?zhǔn)人峋ˋ.avenae，GenBank：NC＿015138）親緣關(guān)系非常接近，所以常常導(dǎo)致檢測(cè)引物無(wú)法區(qū)分這兩個(gè)種［22］。而本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析選取的靶標(biāo)基因?yàn)锳ave＿4063和Aave＿4064，將Aave＿4064序列在NCBI中進(jìn)行BLASTn和tBLASTx比對(duì)，結(jié)果沒有任何已知序列與其相同，在燕麥?zhǔn)人峋蚪M中也未發(fā)現(xiàn)其同源序列，從而保證了檢測(cè)的特異性。利用本文建立基于LAMP 的西瓜嗜酸菌檢測(cè)體系，對(duì)不同寄主上分離到的西瓜嗜酸菌菌株和其他17個(gè)參試菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該體系能特異地?cái)U(kuò)增出西瓜嗜酸菌，能有效區(qū)分開與其親緣關(guān)系較近的菌株，例如燕麥?zhǔn)人峋ˋ.avenae）、卡特萊蘭嗜酸菌（A.cattleyae）、敏捷嗜酸菌（A.facilis）、魔芋嗜酸菌（A.konjaci）及假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌。證明本研究所設(shè)計(jì)的LAMP 檢測(cè)引物種內(nèi)保守、種間特異。在靈敏度試驗(yàn)中，常規(guī)PCR 的檢測(cè)靈敏度為2.0×103cfu／mL，而該體系的最低檢測(cè)靈敏度為2.0×101cfu／mL，比常規(guī)PCR的靈敏度高出100倍。

本研究建立的LAMP 檢測(cè)體系在等溫條件下（65 ℃）就能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)反應(yīng)時(shí)間短，僅需1h，不需要熱循環(huán)儀，一個(gè)普通水浴鍋就可進(jìn)行，這是常規(guī)的PCR 檢測(cè)不能達(dá)到的。在結(jié)果判定時(shí)，本研究采用加入熒光染料鈣黃綠素，產(chǎn)生擴(kuò)增的反應(yīng)管顏色由橙色變?yōu)榱辆G色，未產(chǎn)生擴(kuò)增的則保持橙色不變，該方法既提高了對(duì)檢測(cè)結(jié)果的肉眼識(shí)別率，又可直接用于瓜類細(xì)菌性果斑病的現(xiàn)場(chǎng)診斷，大大提高了檢測(cè)效率。在利用本研究建立的LAMP檢測(cè)體系從瓜種子中檢測(cè)西瓜嗜酸菌時(shí)，包括種子處理的時(shí)間在內(nèi)，共需8h。一般來(lái)說(shuō)，利用半選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌分離和幼苗生長(zhǎng)測(cè)定法是西、甜瓜種子帶菌檢測(cè)的常用方法，一般需要3～8d。所以本研究建立的檢測(cè)體系與常規(guī)方法相比省時(shí)、省力、省錢。

LAMP技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、操作方便等特點(diǎn)，為檢疫性有害生物檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持，對(duì)早期檢疫性有害生物準(zhǔn)確診斷具有重要意義。本研究首次建立了對(duì)西瓜嗜酸菌檢測(cè)的可視化LAMP方法，該方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)儀器設(shè)備和檢測(cè)人員的技能要求不是十分苛刻，其特異性、靈敏度及快速檢測(cè)方面均能夠滿足口岸檢疫和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)單位對(duì)檢疫性有害生物的快速診斷需要，可推廣應(yīng)用于西、甜瓜種苗的健康檢測(cè)中。

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