桑氏鏈霉菌突變株的抑菌活性及對楊樹紫紋羽病的盆栽防效

李姝江，朱天輝，余 琴，譙天敏，韓 珊

（四川農(nóng)業(yè)大學林學院，成都 611130）

隨著對環(huán)境健康、食品安全的重視，逐步降低化學農(nóng)藥用量是控制植物病害的趨勢。由此，開發(fā)高效低毒、環(huán)境兼容性好的替代化學殺菌劑的新型生物農(nóng)藥是目前國內(nèi)外植物保護領域研究的熱點之一［1-2］。盡管如此，由于生防微生物種群的繁殖易受到環(huán)境溫度、濕度、土壤pH 等諸多因素的影響，藥效反應慢，作用效果大多不明顯甚至無效［3-4］。有報道指出［5］，生防微生物和化學農(nóng)藥混合使用，不僅可以降低化學農(nóng)藥的使用量，減輕對環(huán)境的污染，還因為化學殺菌劑削弱了病原菌的生長，使其對生防菌更加敏感，從而提高了生防微生物的防治效果。因此，生物農(nóng)藥的研究和開發(fā)要根據(jù)現(xiàn)有的基礎和優(yōu)勢有針對性地發(fā)展。紫紋羽病又稱紫色根腐病，是由紫紋羽絲核菌（RhizoctoniacrocorumFr.）引起的一種苗木病害。該菌寄主范圍廣泛，達45科，76屬，100多種，包括松、柏、杉、刺槐、楊、榆、桑、柳、蘋果等，是一種重要的土傳病原菌。利用生防微生物防治紫紋羽絲核菌的研究，在國內(nèi)外還未見報道。

鏈霉菌屬（Streptomyces）是放線菌中分布最廣、種類最多的一個屬，也是用于植物病蟲害生物防治最重要的一個屬［6-7］。現(xiàn)已篩選出許多種具有生防價值的鏈霉菌，例如灰黃鏈霉菌（S.flavogriseus）、哥斯達黎加鏈霉菌（S.costaricanus）、灰色鏈霉菌（S.griseus）、利迪鏈霉菌（S.lydicus）、波賽鏈霉菌（S.peucetius）等，這些鏈霉菌在植物病害的防治中起到了重要作用［8］，生防鏈霉菌的研究主要集中在作物病害生物防治方面，如水稻紋枯病［9］、香蕉黑星病［10］、馬鈴薯土傳病害［11］、煙草細菌性枯萎病［12］等，在林木植物上報道較少。鏈霉菌所產(chǎn)生的抗生素［13］、酶類［14-16］等一系列次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)與食品領域已被廣泛開發(fā)利用。桑氏鏈霉菌（S.sampsonii）KJ40是本實驗室從楊樹根系中分離到的一株對紫紋羽絲核菌有較強抑制作用的放線菌［17］，還能夠產(chǎn)生幾丁質酶。國內(nèi)外對該菌研究較少，Jain等［18］從花園的土壤中分離得到S.sampsoniiGS1322菌株，發(fā)現(xiàn)其對指示真菌白色念珠菌（Candidaalbicans）、黑曲霉（Aspergillusniger）、石膏樣小孢子菌（Microsporumgypseum）和毛癬菌屬（Trichophytonsp.）均具有抑制作用。由于野生鏈霉菌對農(nóng)藥抗藥性差，農(nóng)藥對具生防作用的菌株也有殺滅效果。福美雙是一種廣泛應用的植物殺菌劑，對多種疫病、立枯病、猝倒病、根腐病等有較好的防治作用［19］。本研究測定了對福美雙具有抗性的2株桑氏鏈霉菌突變株MV-2、MV-4［20］對8種重要林木真菌的抑制作用，并探索了其發(fā)酵液萃取物和菌絲體浸出物的抑菌活性，研究了抑菌物質在不同溫度、pH、光照、儲藏溫度條件下的穩(wěn)定性及對福美雙耐受性，將抑菌物質與福美雙用于楊樹紫紋羽病的盆栽防治試驗，旨在為將其制作成生物農(nóng)藥投放生產(chǎn)提供實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試拮抗菌和病原菌

桑氏鏈霉菌（S.sampsonii）原始菌株KJ40和抗福美雙突變株MV-2、MV-4［20］，由四川農(nóng)業(yè)大學林學院森林保護省級重點實驗室分離、鑒定、誘變和保存。病原菌：紅豆杉根腐病病菌（終極腐霉PythiumultimumTrow）、板栗疫病病菌［寄生隱叢赤殼菌Cryphonectriaparasitica（Murr.）Barr.］、松落針病病菌［松針散斑殼菌Lophodermiumpinastri（Schrad.）Chevall.］、楊樹紫紋羽病病菌［紫紋羽絲核菌R.crocorum（Pers.）DC.］、雜交竹梢枯病病菌［暗孢節(jié)菱孢菌Arthriniumphaeospermum（Corda）M.B.Ellis］、桉樹焦枯病病菌（帚梗柱枝孢霉CylindrocladiumscopariumMorgan）、山茶灰斑病病菌［茶褐斑擬盤多毛孢Pestalotiopsisguepinii（Desm.）Stey.］、油橄欖孔雀斑病病菌［橄欖環(huán)黑星霉Spilocaeaoleaginea（Cast.）Hughes＝CycloconiumoleaginumCast.］，由四川農(nóng)業(yè)大學林學院森林保護省級重點實驗室提供。

1.2 供試植株

1 年生歐美雜交楊（Populusdeltoides×P.nigra）由四川省崇州市榿泉鎮(zhèn)楊樹苗圃提供。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基（葡萄糖10g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、瓊脂粉20g、NaCl 15g、蒸餾水1 000mL，pH 7.0～7.2）用于放線菌的培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，pH 自然）用于拮抗性測定；發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖10g、黃豆餅粉10g、蛋白胨3g、NaCl 2.5g、CaCO32g、蒸餾水1 000mL，pH 7.0）；所用試劑均為國產(chǎn)AR級試劑。乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯、丙酮、甲醇，購自成都市科龍化工試劑廠；40%福美雙可濕性粉劑，購自山東濰坊萬盛生物農(nóng)藥有限公司。

1.4 KJ40及其突變株MV-2和MV-4的平板抑菌效果測定

采用平板對峙法［21］：將活化的直徑5mm的各病原菌菌碟分別與拮抗菌株KJ40、MV-2、MV-4在PDA平板距中心25mm對稱的兩點接種。26℃培養(yǎng)5d后，觀察記錄抑菌情況，測定病原菌的菌落直徑，計算抑制率，以只接病原菌為對照，每處理重復3次。菌落直徑（mm）＝測量菌落直徑-5.0；菌絲生長抑制率（%）＝（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／對照菌落直徑×100。

1.5 KJ40及其突變株MV-2和MV-4的發(fā)酵液制備

分別將106cfu／mL的KJ40和MV-2、MV-4的孢子懸浮液按1%（v／v）的接種量接種至盛有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，26 ℃、140r／min 振蕩培養(yǎng)3d，發(fā)酵液于12 000r／min離心20min，收集上清液和菌絲體于4℃冷藏備用。

1.6 KJ40及其突變株MV-2和MV-4的發(fā)酵液萃取物和菌絲體浸出物的抑菌作用

萃取液的制備［22］：取MV-2、MV-4，以及原始菌株KJ40的發(fā)酵液，分別用2倍體積的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯溶液萃取，經(jīng)RE2000E旋轉蒸發(fā)器（上海科升儀器有限公司）濃縮至完全干燥，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4℃下冷藏備用。

菌絲體浸出物的制備［22］：取MV-2、MV-4，以及原始菌株KJ40的菌絲體，分別用乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇各50mL超聲處理15min，常溫下浸出48h后過濾，濾液經(jīng)RE2000E旋轉蒸發(fā)器濃縮至完全干燥，用甲醇定容于25mL容量瓶中，4℃下冷藏備用。

抑菌作用測定：采用孔洞法［23］。將供試病原菌菌餅（d＝5 mm）置于PDA 培養(yǎng)基中央，距菌餅3 cm 處用打孔器（d＝5 mm）打孔，每孔加入100μL發(fā)酵液萃取物或菌絲體浸出物，每種病原菌做3次重復，以只接病原菌為對照，置于26 ℃下培養(yǎng)，待對照菌落長滿平板為止，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.7 KJ40及其突變株MV-2和MV-4抑菌活性物質的穩(wěn)定性測定

將KJ40、MV-2和MV-4中抑菌作用最強的有機溶劑萃取液和菌絲體浸出物合并，旋轉蒸發(fā)器濃縮至完全干燥，甲醇溶解，即為含抑菌物質的混合液，以紫紋羽絲核菌為指示菌，測定抑菌活性物質的穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性：將混合液分別置于40、60、80、100和121 ℃下處理30min，冷卻至室溫；酸堿穩(wěn)定性：將混合液分別用0.1mol／L NaOH 和0.1mol／L HCl調(diào)至pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11，4℃過夜，然后再將各pH 調(diào)回至中性；紫外光穩(wěn)定性：將混合液置于28 W 紫外燈下，距離10 cm處分別照射2、4、8、12、24h；耐儲藏性：將混合液置于2mL封口離心管中，分別在-20、4、20、40、60 ℃的恒溫條件下保存30d后，恢復至室溫；對福美雙的耐受性：將混合液與200μg／mL的福美雙按體積比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合；以上各處理均采用1.6中孔洞法測定其抑菌活性，觀察并測量抑菌圈直徑，每處理設3次重復，以未經(jīng)處理的混合液為對照。

1.8 KJ40及其突變株MV-2和MV-4對紫紋羽絲核菌的盆栽防效

盆栽試驗在四川農(nóng)業(yè)大學林學院苗圃中進行。病原菌孢子懸浮液制備：將紫紋羽絲核菌接種于PDA 平板上，25～28℃培養(yǎng)，產(chǎn)孢后用無菌水配成104cfu／mL的孢子懸浮液備用。將楊樹苗扦插于經(jīng)高溫滅菌的土壤里，經(jīng)14d，楊樹苗生根后，分別用（1）MV-2活性物質混合液；（2）MV-4活性物質混合液；（3）KJ40活性物質混合液；（4）200μg／mL的福美雙；（5）200μg／mL的福美雙＋MV-2活性物質混合液（1∶1）；（6）200μg／mL的福美雙＋MV-4活性物質混合液（1∶1）；（7）200μg／mL的福美雙＋KJ40活性物質混合液（1∶1）；（8）CK（無菌水）對楊樹苗進行灌根［24］處理，每隔7d灌根1次，每次20mL，共3次，1個月后用制備的紫紋羽絲核菌孢子懸液60mL進行灌根，每處理10株，重復3次。接種紫紋羽絲核菌30d后，按下列方法進行病害調(diào)查統(tǒng)計，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

病害分級標準［24］：0級，根部健康；1級，側根腐爛＜1／5；2級，1／5≤側根腐爛＜1／3；3級，1／3≤側根腐爛≤2／3；4級，側根腐爛＞2／3甚至整株死亡。發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)／總接種株數(shù)）×100；病情指數(shù)＝［∑（各病級株數(shù)×代表級值）／（總株數(shù)×最高病級數(shù)）］×100；防治效果（%）＝［（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）／對照病情指數(shù)］×100。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0軟件分析處理，LSD 法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 KJ40及其突變株MV-2和MV-4對病原菌的平板抑制效果

平板對峙法測定結果（表1）顯示，KJ40及MV-2、MV-4對鞭毛菌亞門藻狀菌綱的終極腐霉（P.ultimum）無抑制作用；對子囊菌亞門子囊菌綱的寄生隱叢赤殼菌（C.parasitica）和松針散斑殼（L.pinastri）抑制率達到70%以上；對半知菌亞門絲孢綱的暗孢節(jié)菱孢菌（A.phaeospermum）、帚梗柱枝孢霉（C.scoparium）、茶褐斑擬盤多毛孢（P.guepinii）、橄欖環(huán)黑星霉（S.oleaginea）抑制率均超過60%；對擔子菌亞門層菌綱的紫紋羽絲核菌（R.crocorum）的抑制作用最強，菌落直徑均低于15mm，抑菌率高于90%，顯著高于其余供試病原菌。從3種供試拮抗菌抑菌效果上看，MV-2對病原菌抑制作用最強，但在病原菌菌落直徑上除寄生隱叢赤殼菌和松針散斑殼外均與MV-4、KJ40差異不顯著；從抑菌率上看，MV-2對寄生隱叢赤殼菌、松針散斑殼、暗孢節(jié)菱孢菌的抑菌率與MV-4、KJ40差異顯著；MV-2對紫紋羽絲核菌的抑菌率與MV-4差異顯著，但與KJ40差異不顯著。

表1 KJ40及其突變株對供試植物病原真菌的抑菌率1）Table 1 Inhibition rate of KJ40and its mutant strains against tested plant pathogens

2.2 KJ40及其突變株發(fā)酵液萃取物及菌絲體浸出物的抑菌作用

KJ40、MV-2和MV-4發(fā)酵液的不同溶劑萃取物對供試病原菌的抑制作用結果（表2）顯示，4 種有機溶劑萃取物對終極腐霉、茶褐斑擬盤多毛孢、橄欖環(huán)黑星霉無抑制作用，對其余5 種病原菌有不同程度的抑制作用，說明發(fā)酵液萃取物含有某些抗菌物質。在4 種溶劑中，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果高于其余3 種，其中對紫紋羽絲核菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑最大，顯著大于其余病原菌，孔洞周圍出現(xiàn)明顯的透明圈（圖1）。在3 種供試拮抗菌株中，MV-2 和MV-4 抑菌效果大部分略好于原始菌株KJ40，但除乙酸乙酯萃取物對紫紋羽絲核菌和帚梗柱枝孢霉的抑制作用與KJ40 差異顯著外，其余均不顯著。MV-2 抑菌效果略好于MV-4，但差異均不顯著。

表2 KJ40及其突變株發(fā)酵液萃取物對供試病原菌的抑菌活性1）Table 2 Inhibition activity of fermentation extract from KJ40and its mutant strains against tested plant pathogens

圖1 3種拮抗菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對紫紋羽絲核菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of ethyl acetate extracts from three antifugal strains fermentation on Rhizoctonia crocorum

菌絲體浸出物對供試病原菌的抑制作用結果（表3）顯示，4種有機溶劑浸出物對終極腐霉、寄生隱叢赤殼菌、帚梗柱枝孢霉無抑制作用，對其余5種病原菌有不同程度的作用，說明拮抗菌株胞內(nèi)存在抑菌活性物質；結合表2結果，3種拮抗菌對寄生隱叢赤殼菌、帚梗柱枝孢霉有抑菌活性的物質只存在于發(fā)酵液萃取物中，而菌絲體浸出物中存在對茶褐斑擬盤多毛孢、油橄欖環(huán)黑星霉有抑菌作用的物質。同樣，乙酸乙酯浸出物的抑菌效果顯著優(yōu)于其余3種溶劑，其中對紫紋羽絲核菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑最大，顯著大于其余病原菌（P＜0.05）。在3種供試拮抗菌株中，MV-2和MV-4抑菌效果稍好于原始菌株KJ40，但差異不顯著。綜合以上結果，乙酸乙酯萃取所得到發(fā)酵液萃取物和菌絲體浸出物抑菌效果最強。

表3 KJ40及其突變株菌絲體浸出物對供試病原菌的抑菌活性1）Table 3 Inhibition activity of mycelium extracts from KJ40and its mutant strains against tested plant pathogens

2.3 KJ40及其突變株MV-2和MV-4抑菌物質的穩(wěn)定性

MV-2、MV-4和KJ40活性物質經(jīng)不同溫度處理30min后，抑菌活性隨溫度升高而下降（圖2a）。MV-2和MV-4 的抑菌物質經(jīng)40～80 ℃處理30 min，其抑菌活性下降不顯著；100和121 ℃處理后，其抑菌活性雖顯著低于對照和前3個溫度處理，但抑菌圈直徑仍在11 mm 以上；KJ40 中的抑菌物質經(jīng)不同溫度處理后，其抑菌活性降幅顯著，121 ℃處理僅有5.5mm 抑菌圈，說明突變株所產(chǎn)生的活性物質比原始菌株的熱穩(wěn)定性更強。

酸堿穩(wěn)定性結果（圖2b）表明，隨pH 提高，3個拮抗菌株的抑菌活性增強，當pH 為7時，抑菌活性達到最大，抑菌圈與對照差異不顯著；但隨pH 繼續(xù)增大，活性顯著下降。對比突變株和原始菌株，可以看出不管pH 高低，MV-2、MV-4的活性物質對病原菌產(chǎn)生的抑菌圈仍較大，均大于10mm，說明突變株對酸堿的耐受性較強。

在紫外光下經(jīng)不同時間照射后（圖2c），隨時間延長，KJ40及其突變株抑菌物質活性均降低。處理2h，MV-2和MV-4的抑菌活性與未經(jīng)照射的處理差異不顯著，并且其降幅低于KJ40；處理24h，KJ40活性物質的抑菌圈很小，說明其不耐紫外光照射，而MV-2和MV-4對紫外光有一定的耐受性。

圖2 KJ40及其突變株抑菌物質的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of antifungal substance from KJ40and its mutant strains

KJ40 及其突變株在不同溫度中儲藏30d 后（圖2d），各處理的抑菌活性存在差異，-20 ℃和4℃儲藏后3個菌株活性物質的抑菌活性變化不大，特別是2株突變株，其抑菌圈直徑均大于14 mm。但20 ℃儲藏后3個菌株的抑菌活性均有一定程度的降低，KJ40降幅最大；40和60 ℃儲藏后，抑菌物質活性與-20 ℃和4 ℃比均顯著下降。可見活性物質在4 ℃以下低溫儲藏更好。

在按不同比例與福美雙混合后（圖2e），從9∶1到5∶5之間，兩株突變株抑菌物質活性差異不顯著；當福美雙含量繼續(xù)增大，其活性降低。而KJ40抑菌物質加入福美雙后其活性呈顯著下降趨勢，當與福美雙的體積比達到1∶9時，其活性喪失，可見未經(jīng)誘變的菌株對福美雙耐受性較差。

綜合來看，MV-2抑菌物質的穩(wěn)定性強于MV-4，兩者的活性物質比KJ40的活性物質更穩(wěn)定。

2.4 KJ40及其突變株MV-2和MV-4對楊樹紫紋羽病的盆栽防效

KJ40、MV-2、MV-4單獨施用及與福美雙混合施用后，楊樹紫紋羽病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果見表4。結果顯示，單獨接種抑菌物質，MV-2和MV-4的防效顯著優(yōu)于KJ40；MV-2的防效略高于MV-4，但差異不顯著。與單獨施用福美雙相比，MV-4的防效顯著低于福美雙，MV-2的防效雖亦低于福美雙，但差異不顯著。抑菌物質和福美雙混合施用均比單獨施用效果更好，其中MV-2和福美雙混合施用楊樹發(fā)病率顯著降低，病情指數(shù)在10以下，防效最佳，超過80%。KJ40的抑菌物質無論單獨施用還是和福美雙混合施用，效果都不如MV-2和MV-4。以上結果說明，MV-2和MV-4產(chǎn)生的抑菌物質和福美雙混用對楊樹紫紋羽病有協(xié)同防治作用，且比KJ40更適宜在生產(chǎn)實踐中用于病害的防治。

表4 KJ40及其突變株和福美雙對楊樹紫紋羽病的盆栽防效1）Table 4 Control effects of KJ40and its mutants and thiram on poplar purple root disease in potted experiments

3 討論

由于傳統(tǒng)農(nóng)藥以及新型生物農(nóng)藥的局限性，研究者更期望將具有抗藥性的生物農(nóng)藥與化學農(nóng)藥相結合用于植物病害的防治，最大限度地發(fā)掘其生防潛力。本文以前期篩選到的具有抗藥性、拮抗性穩(wěn)定持久的桑氏鏈霉菌KJ40 突變株MV-2、MV-4［20］為基礎，研究其抑菌譜。平板對峙試驗結果顯示，2個突變株除對鞭毛菌亞門藻狀菌綱的終極腐霉無抑制作用外，對其余7株分屬于子囊菌亞門、半知菌亞門和擔子菌亞門的林木病原真菌抑制作用較強。通過4種有機溶劑對KJ40及其突變株發(fā)酵液和菌絲體進行萃取，得到的發(fā)酵液萃取物和菌絲體浸出物活性物質抑菌譜較廣，但仍對終極腐霉無作用，其中乙酸乙酯萃取的物質活性最強。汪鷹［25］報道灰藤黃鏈霉菌（Streptomycesgriseoluteus）產(chǎn)生的多種吩嗪類活性代謝產(chǎn)物對終極腐霉有強烈抑制作用，與本試驗結果不同，但鏈霉菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物多種多樣，進一步的研究將集中在KJ40發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質的分離純化及結構鑒定，并對抑菌機理進行探索。結果中突變株和原始菌株及其活性物質均對楊樹紫紋羽病病原菌紫紋羽絲核菌抑制作用最強，這可能與桑氏鏈霉菌本身就來自楊樹根系有關。突變株MV-2及其活性物質抑菌作用最強，可能與誘變前后菌株產(chǎn)生的抑菌物質種類有所不同使得抑菌效果不同有關。本文只選擇幾種代表性林木病原真菌，為將桑氏鏈霉菌發(fā)展成為廣譜性生防菌，下一步試驗應擴大測試病原菌范圍。

在穩(wěn)定性檢測中，MV-2 和MV-4 產(chǎn)生的抑菌物質具有較好的熱穩(wěn)定性、較寬的pH 作用范圍，抗紫外線輻射能力也較強，而原始菌株各種穩(wěn)定性均較差，因此，突變株的特性使其在生產(chǎn)實踐中比原始菌株更能適應環(huán)境，具有更大的開發(fā)潛力。但在高溫中儲藏后抑菌物質的活性顯著下降，結合隋勤等［2］的報道，可合理選擇相應的穩(wěn)定劑等助劑，對將實際投入應用的生防制劑劑型進行深加工，以增加其貨架期和田間防治效果。另外，MV-2、MV-4和KJ40對福美雙的耐受性也表明，突變株抑菌混合物在與福美雙不同配比下其活性仍較強，而原始菌株抑菌活性則顯著降低甚至喪失。

雖然筆者曾將桑氏鏈霉菌發(fā)酵液直接用于楊樹紫紋羽病的防治［17］，但由于鏈霉菌在自然條件下定殖及繁殖能力還不夠穩(wěn)定［26］，如果直接和農(nóng)藥混用，將限制生防菌的存活率和向侵染部位的轉運效率［27］。本試驗嘗試將桑氏鏈霉菌突變株產(chǎn)生的抑菌物質用于病害的防治，獲得了很大突破，作用方式更直接，生物活性成分更高，這與張曉云［28］將枯草芽胞桿菌抗菌蛋白應用于黃瓜白粉病中的結果一致。盆栽試驗還表明，福美雙＋MV-2活性物質混合施用防效最好，顯著高于兩者單獨施用，MV-2、MV-4的抑菌物質對病原菌的抑制作用較KJ40有所提高；能讓紫紋羽絲核菌無法擴展生長，達到殺滅紫紋羽絲核菌的效果。這一結果有效降低放線菌抗菌物質對化學藥劑的敏感性，增加其生防潛能，使生防菌劑與殺菌劑協(xié)同效應在綜合防治體系中的應用成為可能。但本試驗中用的是無菌土，田間試驗的環(huán)境比盆栽試驗更為復雜，生防菌會受到溫度、濕度、土壤pH 等的影響，田間試驗的結果可能會與盆栽試驗不一致［29］。MV-2、MV-4及其活性物質能否在田間土壤中定殖、在田間試驗中是否具有防治作用還需進一步探究。

［1］Jarvis P著，關愛瑩，劉長令編譯.生物農(nóng)藥的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.農(nóng)藥科學與管理，2002，33（3）：29-30.

［2］隋勤，劉偉成，裘季燕，等.利迪鏈霉菌A02的抑菌譜及其抑菌活性的穩(wěn)定性［J］.植物保護，2007，33（5）：67-71.

［3］付小軍，盛鑫，馬進，等.植物病害生物防治概述［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學，2011（4）：138-139.

［4］胡燕梅，楊龍.利用微生物防治植物病害的研究進展［J］.中國生物防治，2006，22（S1）：190-193.

［5］田連生，馮樹波.耐藥性木霉菌株的篩選及其對灰霉病的防治［J］.生物技術，2005，15（5）：26-28.

［6］周鑫鈺，朱宏建，雷湘華，等.植物內(nèi)生放線菌應用研究進展［J］.江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22（12）：87-90.

［7］El-Tarabily K A，Soliman M H，Nassar A H，et al.Biological control ofSclerotiniaminor using a chitinolytic bacterium and actinomycetes［J］.Plant Pathology，2000，49（5）：573-583.

［8］薛磊，王建濤，劉相春，等.拮抗性鏈霉菌對大麗輪枝菌微菌核形成與萌發(fā)的影響［J］.植物保護學報，2012，39（4）：289-296.

［9］曹琦琦，周登博，鄭麗，等.水稻紋枯病菌拮抗菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件探索［J］.中國生物防治學報，2013，29（2）：270-276.

［10］廖東奇，曾濤，馬婷，等.放線菌WZ1-5019的鑒定及其發(fā)酵液對香蕉黑星病的田間防治效果試驗［J］.熱帶作物學報，2011，32（5）：932-936.

［11］陳杰，湯琳，郭天文，等.馬鈴薯土傳病原真菌拮抗放線菌的抗病促生作用［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2014，42（1）：111-119.

［12］Han Xinyu，Zhang Chengsheng，Chen Xue，et al.Screening，identification and biocontrol effect of antagonisticStreptomycesstrain Tra69against tobacco bacterial wilt［J］.Plant Diseases and Pests，2012，3（1）：10-13，32.

［13］陳祈磊，趙子翰，王輅，等.黃灰鏈霉菌SIIA-A02191產(chǎn)生的多環(huán)口山酮類新抗生素Bromoxantholipin［J］.中國抗生素雜志，2011，36（8）：566-570.

［14］Bentley S D，Chater K F，Cerde?o-Tárraga A M，et al.Complete genome sequence of the model actinomyceteStreptomyces coelicolorA3（2）［J］.Nature，2002，417（6885）：141-147.

［15］Kuhad R C，Kapoor M，Rustagi R.Enhanced production of an alkaline pectinase fromStreptomycessp.RCK-SC by wholecell immobilization and solid-state cultivation［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，20（3）：257-263.

［16］Chakraborty S，Khopade A，Kokare C，et al.Isolation and characterization of novelα-amylase from marineStreptomycessp.D1［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，58（1-4）：17-23.

［17］李姝江，朱天輝，彭艷，等.桑氏鏈霉菌產(chǎn)幾丁質酶特性及對楊樹紫紋病的生防作用［J］.東北林業(yè)大學學報，2014，42（3）：116-121.

［18］Jain P K，Jain P C.Isolation，characterization and antifungal activity ofStreptomycessampsoniiGS 1322［J］.Indian Journal of Experimental Biology，2007，45（2）：203-206.

［19］楊春林，席亞東，謝華蓉，等.耐福美雙的哈茨木霉菌株誘導及其幾丁質酶生防特性研究［J］.云南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，25（2）：183-188.

［20］余琴，朱天輝，李姝江，等.耐福美雙桑氏鏈霉菌生物型的選育［J］.東北林業(yè)大學學報，2014，42（7）：73-77.

［21］賈翠英，張玉輝，吳志洋.紫外誘變與羧甲基半胱氨酸復合篩選高產(chǎn)L-精氨酸菌株［J］.核農(nóng)學報，2012，26（6）：879-883.

［22］賀建武，劉祝祥，龍華，等.波賽鏈霉菌JMC 06001抑菌活性物質的特性研究［J］.微生物學雜志，2011，31（1）：10-14.

［23］李姝江，梁漫，朱天輝，等.雜交竹梢枯病拮抗菌的篩選及抗菌蛋白分析［J］.南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2013，37（6）：27-32.

［24］趙桂華，王海明，牛迎福，等.楊樹紫紋羽病發(fā)生與防治［J］.西部林業(yè)科學，2010，39（1）：86-89.

［25］汪鷹.鏈霉菌P510 中吩嗪類抗生物質的分離純化［D］.上海：上海交通大學，2010.

［26］王家琛，蔣繼志.放線菌MC-15發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性及對馬鈴薯晚疫病的防治［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26（19）：253-257.

［27］Fernando W G D，Nakkeeran S，Zhang Y，et al.Biological control ofSclerotiniasclerotiorum（Lib.）de Bary byPseudomonasandBacillusspecies on canola petals［J］.Crop Protection，2007，26（1）：100-107.

［28］張曉云.枯草芽孢桿菌菌株CAB-1抑菌物質的分離鑒定及活性分析［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2011.

［29］林珊.十字花科根腫病菌Plasmodiophorabrassicae生防菌的篩選及其誘變選育［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2012.