miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠對米托蒽醌敏感性機制探討*

中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科(沈陽 110001)

關 舒 于鑫淼 毛曉韻 魏敏杰△ 金 鋒 何 苗

miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠對米托蒽醌敏感性機制探討*

中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科(沈陽 110001)

關 舒 于鑫淼 毛曉韻 魏敏杰△金 鋒 何 苗

目的：研究miR-487a調控米托蒽醌(MX)耐藥的乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX荷瘤鼠對MX敏感性的作用與機制。方法：通過裸鼠腋窩皮下接種MCF-7/MX細胞構建荷瘤鼠模型；real-time RT-PCR、Western blot方法檢測荷瘤鼠瘤體內注射miR-487a agmir后對移植瘤內miR-487a及BCRP表達的影響；并通過對荷瘤鼠尾靜脈注射MX后移植瘤體積和瘤重的檢測，研究miR-487a對MCF-7/MX荷瘤鼠藥物敏感性的影響。結果：在MCF-7/MX細胞荷瘤鼠瘤體內注射miR-487a agmir誘導miR-487a表達增高約7倍；降低了移植瘤內的BCRP的mRNA和蛋白表達約30%；且顯著降低了MX處理的MCF-7/MX細胞荷瘤鼠移植瘤的重量，即增加了對MX的敏感性。結論：miR-487a抑制了MCF-7/MX細胞荷瘤鼠的BCRP表達，增加其對米托蒽醌的敏感性。

米托蒽醌(MX)是常見的乳腺癌治療用藥，但化療過程中出現的耐藥問題嚴重影響了其臨床療效和患者的預后。miRNA是一種大小約21-25bp的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，為一組不編碼蛋白質的短序列RNA。miRNA通過與特定靶基因的3’端非編碼區(3’UTR)特異結合，調節靶基因的蛋白翻譯過程調控基因的表達[1]。近些年，miRNA調節腫瘤細胞耐藥的作用引起廣大學者的關注[2,3]。本實驗對裸鼠進行米托蒽醌(MX)耐藥的乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX皮下注射，構建了在體移植瘤模型，檢測荷瘤鼠瘤體內注射miR-487a agmir后對移植瘤內miR-487a及BCRP表達的影響；并以MX處理上述模型后，觀察小鼠對MX的敏感性改變，探討荷瘤鼠水平時miRNA-487a對BCRP介導的乳腺癌耐藥作用的調控及可能機制。

材料和方法

1 細胞培養 米托蒽醌(MX)耐藥的MCF-7人乳腺癌細胞(MCF-7/MX)，在含10%的FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM(Invitrogen, USA)培養基，5% CO2、37℃細胞培養箱中培養。MCF-7/MX細胞系培養時需定時加入MX誘導耐藥。

2 裸鼠移植瘤模型建立 BALB/c無胸腺雌性裸鼠(4～6周齡)，飼養在中國醫科大學實驗動物中心SPF級動物室。將MCF-7/MX細胞(8×106)懸浮于PBS中，200 μl接種到裸鼠的腋窩皮下。當腫瘤平均體積大小達到約100～200mm3時，將移植裸小鼠隨機分成2組(每組n=6)：陰性對照組(NC)agmir組和miR-487a agmir，兩組小鼠分別瘤體內注射1nM的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周兩次，共5次注射。

在考察miR-487a對MX的抗腫瘤作用影響的實驗中，將荷瘤鼠隨機分成3組(每組n=6)：NC agmir，NC agmir + MX和miR-487a agmir + MX治療組，3組小鼠分別瘤體內注射1 nM 的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周兩次，共5次注射。NC agmir+ MX和miR-487a agmir+ MX治療組小鼠，同時給予每周兩次尾靜脈注射MX(1.5 mg/kg)，共5次注射。

3 qRT-PCR分析 qRT-PCR方法檢測BCRP的mRNA表達。RNA提取試劑盒提取移植瘤總RNA，逆轉錄PCR體系：100 ng RNA、50 μM Oligo dT、dNTPs各0.125 mM、60 U/μl M-MLV、1 U/μl RNA酶抑制劑、5×RT 緩沖液；條件：42℃ 30min、85℃ 5min、4℃恒溫。PCR體系：1 μl cDNA、6.25 μl 2×SYBR、0.25 μl ROX、1 μl上下游引物(10 μM)、3 μl ddH2O；PCR條件：95℃ 預變性2min，95℃30s、60℃45s、72℃30s8個循環，95℃30s、56℃45s、72℃30s35個循環，β-actin用作內參。mRNA的變化情況用2-ΔΔCT計算和表示。實驗至少重復3次取平均值。

4 Western-Blot 分析 將裸鼠腫瘤組織經超聲勻漿，提取蛋白。蛋白定量后，與上樣緩沖液混合(1∶5)，煮沸變性。10%SDS-PAGE電泳后，濕轉過夜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗BCRP(1∶1000, Abcam)，4℃過夜。二抗(1∶3000，Santa Cruz Biotechnology)，室溫1 h孵育。ECL化學發光。

結 果

1 miR-487a agmir誘導MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤內miR-487a高表達 我們在4～6周雌性裸鼠的肩胛處皮下注射MCF-7/MX細胞懸液(8×106)制備移植瘤模型，當移植瘤體積達到約100～200mm3時，瘤內注射miR-487a agmir或NC agmir。4周后，應用real-time RT-PCR檢測移植瘤內miR-487a的表達情況。結果發現：miR-487a agmir轉染組miR-487a的表達約為NC組的7倍，表明瘤體內多點注射轉染miR-487a agmir可誘導荷瘤鼠移植瘤組織miR-487a持續高表達(P<0.05)。

2 miR-487a agmir抑制MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤的BCRP表達 我們通過real-time RT-PCR和Western blot分別檢測了移植瘤內BCRP的mRNA和蛋白表達情況，發現：與NC組相比，miR-487a agmir轉染組中BCRP mRNA表達水平降低約30%(P<0.05)；miR-487a agmir轉染組中BCRP 的蛋白表達也受到明顯的抑制。表明miR-487a可抑制MCF-7/MX荷瘤鼠的乳腺癌耐藥蛋白BCRP的表達。

3 miR-487a agmir增強MCF-7/MX細胞荷瘤鼠對MX的敏感性 上述實驗證實了miR-487a agmir能夠抑制MCF-7/MX細胞荷瘤鼠移植瘤內BCRP的表達，為了考察其是否因此而增強荷瘤鼠對MX的敏感性，我們檢測了miR-487a agmir瘤體內注射的MCF-7/MX細胞荷瘤鼠，給予尾靜脈注射MX后移植瘤的生長情況。荷瘤第31天實驗結束，處死小鼠，取瘤組織稱重發現：與miR-NC+MX組相比，miR-487a agmir+MX組的瘤重減輕更明顯。表明miR-487a agmir增強了MX對荷瘤鼠重量的抑制作用。這些結果證實了miR-487a agmir增強了MCF-7/MX細胞荷瘤鼠對MX的敏感性。

討 論

乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)是三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(Adenosine triphosphate binding cassette transporters, ABC)家族中的重要成員之一，由ABCG2基因編碼[4]，可特異性將米托蒽醌等轉運底物從細胞內轉運到細胞外，導致細胞內藥物濃度降低，最終引起腫瘤細胞對化療藥物的敏感性下降，即產生多藥耐藥(MDR)[5]。miRNA作為非編碼RNA之一，主要通過與目標mRNA分子的3’端非編碼區(3’UTR)特異結合，然后在轉錄后水平抑制靶基因的翻譯和表達。若其靶基因為原癌基因，調控其表達的miRNA則發揮抑癌基因的活性；相反，如靶基因為抑癌基因，則調控其表達的miRNA作為癌基因發揮作用。因此，miRNA對于腫瘤的發生發展起著非常重要的調控作用，約60%的基因表達由miRNA調控。

有細胞實驗證實了某些miRNA可調節BCRP的表達，如Wang等[6]在胰腺癌中發現hsa-miR-520h下調BCRP的表達，抑制腫瘤的轉移，侵襲和干性。但是在動物實驗中相關研究報道不多。于是，本實驗參照Jin等[7]的方法，將MCF-7/MX細胞進行裸鼠皮下接種7d移植瘤長到約100～200mm3后，將1 nmol的miR-487a agmir進行裸鼠移植瘤內多點注射，同時給予尾靜脈注射MX(1.5 mg/kg)處理，發現miR-487a agmir注射后可使瘤組織內miR-487a表達增加，提示可通過瘤體內多點注射的方式使miR-487a在體內持續高表達。且我們發現瘤體內注射miR-487a agmir后可使瘤組織BCRP表達下調，移植瘤的重量下降，即增加MX抑制腫瘤生長的作用。有力的證明了miR-487a在調控乳腺癌細胞BCRP表達及藥物敏感性方面具有重要作用，同時為荷瘤鼠在體轉染miRNAs進行靶向調控乳腺癌BCRP表達與功能的研究，提供了切實可行的實驗方法。

[1] Taylor MA, Schiemann WP. Therapeutic opportunities for targeting microRNAs in cancer[J]. Mol Cell Ther,2014, 2(30):1-13.

[2] Toden S, Okugawa Y, Jascur T,etal. Curcumin mediates chemosensitization to 5-fluorouracil through miRNA-induced suppression of epithelial-to-mesenchymal transition in chemoresistant colorectal cancer[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(3):355-367.

[3] Van Roosbroeck K, Pollet J, Calin G. miRNAs and long noncoding RNAs as biomarkers in human diseases. Expert Rev[J]. Mol Diagn, 2013, 13(2): 183-204.

[4] Karibe T, Hagihara-Nakagomi R, Abe K,etal. Evaluation of the Usefulness of Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) Knockout Mice andBCRP Inhibitor-Treated Monkeys to Estimate the Clinical Impact of BCRP Modulation on the Pharmacokinetics of BCRP Substrates[J]. Pharm Res,2015, 32(5):1634-1647.

[5] Jani M, Ambrus C, Magnan R,etal. Structure and function of BCRP, a broad specificity transporter of xenobiotics and endobiotics[J]. Arch Toxicol,2014, 88(6):1205-1248.

[6] Wang F, Xue X, Wei J,etal. hsa-miR-520h downregulates ABCG2 in pancreatic cancer cells to inhibit migration, invasion, and side populations[J]. Br J Cancer,2010, 103(4):567-574.

[7] Hou J, Lin L, Zhou W,etal. Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell, 2011, 19(2):232-243.

(收稿：2015-07-19)

The study of mechanisms of miR-487a on increasing the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to mitoxantrone (MX) Department of Breast Surgery, the First Hospital of China Medical University

(Shenyang 110001)

Guan Shu Yu Xinmiao Mao Xiaoyun et al

Objective: To explore the action and mechanisms of miR-487a on the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX. Methods: The xenograft mice were constructed by inoculating subcutaneously MCF-7/MX cells into the flank of nude mice. The expression of miR-487a and breast cancer resistance protein (BCRP) in xenograft tumors induced by MCF-7/MX cells after injecting miR-487a agmir were examined by real-time RT-PCR and Western blot analysis. The sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX was analyzed by observing the changes of the tumor weight. Results: The intratumoral injections of miR-487a agmir induced the increases of miR-487a by 7 fold, decreased the mRNA and protein expression of BCRP by 30%, and significantly reduced the tumor weight of the xenograft mice. Concluslon: miR-487a can inhibit the expression of BCRP and increase the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX.

Breast neoplasms @microRNAs Animals,laboratory Rats Nude

*國家自然科學基金(81102472, 81341063, 81201886)

乳腺腫瘤 @microRNAs 動物，實驗 大鼠，裸

R655.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.002

沈陽市科技計劃項目(F12-148-9-00)

△通訊作者:中國醫科大學藥學院藥理教研室