參附芎澤方對心衰大鼠血流動力學及心肌纖維化的作用*

韓 曼 馬 莉 王 菲 于遠望

陜西中醫藥大學基礎醫學院(咸陽712046)

參附芎澤方對心衰大鼠血流動力學及心肌纖維化的作用*

韓 曼 馬 莉 王 菲 于遠望△

陜西中醫藥大學基礎醫學院(咸陽712046)

目的：觀察參附芎澤方對冠脈結扎所致心衰大鼠血流動力學及心肌纖維化的干預作用并探討其相關機制。方法：SD大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組、方藥組。模型組、方藥組結扎冠狀動脈左前降支，假手術組只穿線不結扎。方藥組每次經口灌服參附芎澤濃縮液；假手術組、模型組灌服等劑量生理鹽水。各組干預8周后采用血流動力學檢測評價心功能，Masson染色觀察心肌纖維化程度，Western blotting檢測心肌TGF-β1表達的變化。結果：與模型組相比，方藥組左室舒張末壓(LVEDP)顯著降低，左室收縮壓(LVSP)、左室內壓上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)明顯升高；同時，方藥組可使心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積減少，心肌TGF-β1的表達降低。結論：參附芎澤方可改善冠脈結扎所致心衰大鼠的心功能，抑制心肌纖維化，其機制可能與降低心肌TGF-β1表達有關。

心力衰竭(Heart failure, HF)是各種心血管疾病終末階段的共同表現，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全[1]。對HF發生機制的探索發現，心肌重塑是HF發生發展的基本機制，而心肌纖維化是心肌重塑的關鍵病理特征和重要形成原因。發生纖維化的心肌變得僵硬，心肌收縮與舒張功能障礙，心功能逐步減退，故心肌纖維化是心功能由代償期向失代償期轉化的關鍵[2]。本文探討參附芎澤方對冠狀動脈結扎后心衰大鼠血流動力學與心肌纖維化的作用，以期為心梗后的心肌纖維化干預開辟新的途徑。

1 實驗材料 1.1實驗動物 實驗選用健康、雄性Sprgue-Dawley大鼠(260～290g)40只，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供(動物合格證號：SCXK(陜)2012-003)。動物在標準環境下飼養，12h晝夜循環光照，自由飲水攝食。

1.2 主要藥品與試劑 戊巴比妥鈉購自Sigma；Western blotting相關試劑購自Amresco；兔抗TGF-β1多克隆抗體購自Abcam；肝素鈉注射液(天津生物化學制藥有限公司，產品批號：20111103)；中藥材購于陜西中醫藥大學附屬醫院，參附芎澤方藥由人參、黃芪、附子、川芎、丹參、澤瀉六味中藥構成。將中藥制成煎煮液，生藥含量為2g/mL。

1.3 實驗儀器 BL-420A生物機能實驗系統(成都泰盟生物科技有限公司)；HX-100E小動物呼吸機(成都泰盟軟件有限公司)。

2 實驗方法 2.1 心衰模型制備 實驗動物稱重后以2%戊巴比妥鈉(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于自制手術臺上，對文獻介紹的冠狀動脈結扎法[3]進行改良。首先采用無創性氣管插管行人工呼吸；其次手術區備皮，碘伏消毒，沿左側第3～4肋間隙做一約1～1.5 cm縱行切口，依次分離皮膚、筋膜、肋間肌，大鼠擴胸器撐開肋間肌暴露心臟，用脫脂棉小心撕開心包膜擠出心臟，一次性縫合針快速從心尖處穿過(切勿穿透心肌)，左手持線將心臟輕輕拉出胸腔，心臟搏動減緩，右手持持針器將另一一次性縫合針從左心耳下緣中點處進針，深度約0.15 cm，在肺動脈圓錐底部靠近冠狀靜脈的部位出針，迅速結扎(假手術組只穿線不結扎)，結扎后左室壁顏色較周圍變淺，同時心電圖ST段抬高，證明結扎成功。取出心尖的一次性縫合線，將心臟送回胸腔，清除胸腔內積血，排出胸腔內氣體，連續縫合肋間肌、縫皮并對切口消毒。術后單籠喂養，青霉素20萬U腹腔注射，連續3d，預防感染。

2.2 動物分組及給藥方法 實驗動物隨機分為2組，假手術組(10只)和冠脈結扎組(30只)，假手術組術中死亡2只，冠脈結扎組術中死亡8只，術后死亡2只。冠脈結扎組術后8周，大鼠隨機分為模型組(10只)、方藥組(10只)。方藥組每次經口灌服參附芎澤濃縮液2 mL，總藥量相當于成人給藥劑量的20倍；假手術組、模型組灌服等劑量生理鹽水，各組干預均為8周。

2.3 血流動力學指標的測定 各組大鼠灌胃8周，于末次進食24h后，稱重，2%戊巴比妥鈉(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，將充滿肝素生理鹽水的PE50導管，一端連接生物信號采集處理系統，一端沿右側頸總動脈插入左心室腔內，待壓力曲線穩定后，記錄5 min血流動力學相關指標：心率(Heart rate, HR)、平均動脈壓(Mean arterial pressure, MAP)、左室收縮壓(Left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒張壓末壓(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室內壓上升和下降最大速率(Left ventricular pressure maximum rising and falling rates, ±dp/dtmax)。

2.4 Masson染色觀察心肌纖維化的程度 血流動力學指標檢測后，處死大鼠，取出心臟，生理鹽水沖洗,濾紙吸干，剪取左心室，部分置液氮轉-80 ℃冰箱貯存，備檢測Western blotting；部分置于10%甲醛固定48 h后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片機切片，行Masson三色染色(心肌纖維胞質呈紅色、胞核深藍色，膠原纖維藍色)，顯微鏡下觀察拍照，并測定膠原纖維的容積比。

2.5 Western blotting法檢測心肌TGF-β1蛋白表達的變化 將貯存于-80℃冰箱中的心肌組織每個樣本取100 mg，裂解提取總蛋白。10% SDS-PAGE分離蛋白，300 mA轉膜2 h，將蛋白轉至PVDF膜。1%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加Ⅰ抗(anti-TGF-β1)后，4℃過夜。將膜放入密封袋中加Ⅱ抗，室溫搖床上輕搖1 h，化學發光試劑放射自顯影。

2.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準誤表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統計學意義。

3 結 果 3.1 血流動力學的改變 各組大鼠HR、MAP無顯著性差異(P>0.05)。與假手術組相比，模型組大鼠LVSP、±dp/dtmax顯著降低(P<0.05)，LVEDP則明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，方藥組大鼠 LVSP、±dp/dtmax顯著升高(P<0.05)，LVEDP則有所降低(P<0.01)，詳見表1。

表1 各組大鼠血流動力學比較

注：與假手術組相比△P<0.05，◇P<0.01；與模型組相比▲P<0.05，◆P<0.01

3.2 心肌纖維化的改變 如圖1所示，假手術組大鼠心肌細胞間和血管周圍有少量的膠原纖維；模型組大鼠心肌細胞間和血管周圍可見分布彌散的片狀或小灶狀膠原纖維，其含量與假手術組相比顯著增加(P<0.01)；方藥組大鼠心肌膠原纖維含量較模型組明顯減少(P<0．05)，詳見表2。這一結果提示: 參附芎澤方能抑制心衰大鼠心肌膠原的沉積。

圖1 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化變化(400×)

組 別膠原纖維容積比假手術組12.34±1.67模型組 48.72±2.55△方藥組 23.63±0.45▲

注：與假手術組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05

3.3 心室肌TGF-β1蛋白表達的變化 Western blotting法結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠TGF-β1表達顯著增多(P<0.01)，提示心肌中有細胞因子的浸潤；與模型組大鼠相比，方藥組大鼠TGF-β1表達明顯降低(P<0.05)，表明參附芎澤方能抑制心衰大鼠心肌中細胞因子TGF-β1的浸潤，結果如圖2與表3所示。

圖2 Western blotting 檢測各組大鼠心肌組織中

組別心肌組織TGF-β1的表達(相對于GAPDH)假手術組0.23±0.17模型組 0.79±0.22△方藥組 0.40±0.12▲

注：與假手術組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05

4 討 論 各種心血管疾病發展的終末期均可引起HF，對人類的健康造成了嚴重的威脅。冠脈結扎術建立的心梗后HF是研究HF常用的動物模型，該模型能夠很好的模擬心梗后心肌肥大、心肌膠原沉積，并逐漸演變到HF的全部病理過程，模型呈現的HF和神經內分泌激活方式與人類心衰過程相似[3]。以往研究表明，冠狀動脈左前降支結扎4周后即可發生心室重構，8～12周可發展成HF[4]。本實驗通過直接測定大鼠血流動力學指標發現：冠脈結扎8周后，反應左心室收縮功能的指標LVSP、±dp/dtmax比正常對照組有所下降，而反映左心室舒張功能的指標LVEDP比正常對照組顯著增加，提示冠狀動脈左前降支結扎8周后，大鼠心臟的收縮與舒張功能均嚴重受損，達到HF的標準。

現代醫學認為，HF發生發展的基本機制是心肌重塑，心肌由三個密不可分的成分(心肌細胞、細胞外基質、毛細血管微循環)構成，這種構成為HF提供了心肌重塑的靶點。其中，細胞外基質主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維組成，對心臟起到支持和保護作用，無論何種原因(包括心梗)引起心肌受損，只要病變持續，終將導致Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積增多、比例失調、排列紊亂，即，心肌纖維化[5]。發生纖維化的心肌變得僵硬，擴張性下降，心肌收縮障礙，使得心臟功能逐步減退。本研究結果顯示，冠脈結扎后心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積增加，心肌纖維化顯著，經方藥干預后，心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積顯著減少，心肌纖維化的程度明顯降低。血流動力學檢測結果表明，冠脈結扎后心衰大鼠心功能降低，而經方藥干預的大鼠心功能各項指標均有改善，這與兩組大鼠心肌纖維化的結果一致。

TGF-β1是重要的促纖維化生長因子，也是導致心肌纖維化諸多因素中最后的共同中介物之一，已被公認是器官纖維化的治療靶標[5-6]。研究表明：TGF-β1在各種原因引起的心肌纖維化中均有較高表達。在動物模型及患有心臟疾病的病患的心肌組織中都發現了心肌纖維化以及TGF-β1的過表達。Brook等發現TGF-β1雜合子小鼠比野型對照組小鼠心肌纖維化明顯減少，心功能明顯增加。Kuwahara等也發現阻滯TGF-β1可對大鼠心肌纖維化起到治療作用。本研究中冠脈結扎后心衰大鼠TGF-β1的表達增多，經方藥干預后心衰大鼠心肌TGF-β1的表達明顯降低，這與兩組大鼠心肌纖維化的程度相一致，提示參附芎澤方通過降低心衰大鼠心肌TGF-β1的表達抑制心肌纖維化，從而改善心功能。

參附芎澤方由黨參、黃芪、丹參、附子、川芎、澤瀉組成，方中黨參和黃芪具有益氣強心作用，且可改善心肌能量代謝[7-8]，另外,黃芪還有心肌保護作用；丹參和川芎具有活血通經、祛瘀止痛、清心除煩和滋補之功效作用[9]，國內學者研究發現丹參可抑制心肌成纖維細胞的增殖和膠原的合成，具有良好的拮抗心肌重塑的作用[10]，川芎中的川芎嗪具有鈣離子拮抗作用，使血管舒張，降低心室后負荷，減輕心室重塑[11]；附子和澤瀉具有溫陽利水作用，減輕心室前負荷，改善心功能[12]。本研究結果提示，參附芎澤方對心衰大鼠心功能具有顯著改善作用，其機制之一可能通過減少心肌TGF-β1的表達，從而抑制心肌纖維化實現的。

[1] 戴閨柱.心力衰竭的發展回顧與展望[J].中華心血管病雜志, 2015,43(02):104-107.

[2] Wu MF, Lu SC, Li M. The effectiveness and mechanism of Chinese medicine and pharmacy in intervening myocardial fibrosis[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 2014,34(7):887-91.

[3] Haidara MA, Assiri AS, Yassin HZ, et al. Heart Failure Models: traditional and novel therapy[J].Curr Vasc Pharmacol, 2015,13(1):1-12.

[4] 莫新玲, 謝福生, 嚴冬雪, 等.冠狀動脈結扎與腹主動脈縮窄所致慢性心力衰竭大鼠模型比較[J]. 華夏醫學, 2010,22(1):4-6.

[5] Kong P, Christia P, Frangogiannis NG. The pathogenesis of cardiac fibrosis[J]. Cell Mol Life Sci, 2014,71(4):549-574.

[6] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H, et al. Transforming growth factor β1(TGFβ1) in physiology and pathology [J]. Endokrynol Pol, 2013,64(5):384-396.

[7] 王振富. 黨參對大強度耐力訓練大鼠心肌線粒體抗氧化能力的影響[J]. 江蘇醫藥, 2011,37(13):1515-1517.

[8] 于 妍, 王碩仁, 聶 波, 等. 黃芪注射液在逆轉心肌細胞肥大過程中對心肌細胞線粒體結構和功能的影響[J].中國中藥雜志, 2012,37(7):979-983.

[9] 張尚鵬, 徐星娥, 陳華棟,等. 丹參酮ⅡA對心血管系統的藥理作用及臨床應用[J].中國鄉村醫藥雜志, 2015,22(1):80-81.

[10] 馮 俊, 李樹生, 屠恩遠. 丹參酮ⅡA通過下調CTGF抗血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成[J].中國中醫急癥, 2012,21(4):560-561,573.

[11] 姜 宏, 施廣飛, 朱 珠. 川芎嗪的心腦血管藥理作用及臨床應用研究進展[J].中國中西醫結合雜志, 2013,33(5):707-711.

[12] 成向進, 張會哲, 林朝亮, 等. 溫陽活血利水方藥干預重度心力衰竭(陽虛水泛證)臨床研究[J].四川中醫, 2015,33(1):68-70.

(收稿2015-03-22；修回2015-04-15)

Effects of Shenfu Xiongze Decoction on Hemodynamics and Myocardiac Fibrosis in Heart Failure Rats

Han Man Ma Li Wang Fei et al

School of Basic Medicine，Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Obiective：To explore therapeutic effects of the Shenfu Xiongze Decoction on hemodynamics and myocardiac fibrosis in rats with heart failure (HF) induced coronary artery ligature. Methods: SD rats were randomly divided into three groups: sham operated group, model group and herbs group. The rats of modle group and herbs group received the ligation of left anterior descending artery, while the rats of sham group were accepted sham operation (without ligation of left anterior descending artery, the rest of the operation was the same as the model). The herbs group were fed with Shenfu Xiongze Decoction, sham group and model group were fed with saline. After 8 weeks, hemodynamic evaluation were conducted to determine the cardiac functions．Masson staining was used to observe the degree of myocardial fibrosis．The protein level of transforming growth factors-β1(TGF-β1) was detected by Western blotting. Results: Compared with model group, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) decreased in the herbs group. At the same time, left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular pressure maximum rising and falling rates (±dp/dtmax) increased significantly in the herbs group. Herbs reduced the degree of myocardial collagen deposition (P<0.01) and decreased the expression of TGF-β1. Conclusion: Shenfu Xiongze Decoction improves heart functions and inhibits myocardial fibrosis in rats with HF induced by coronary artery ligature by decreasing TGF-β1protein expression level．

Heart failure/traditional Chinese medicine therapy Hemodynamics Animal experimentation Rats @Shenfu Xiongze decoction

* 陜西省中醫藥管理局中醫藥科研項目(13-LC066；13LC061)

心力衰竭/中醫藥療法 血流動力學 動物實驗 大鼠 @參附芎澤方

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.051

△通訊作者