木犀草素預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應及細胞凋亡的影響

樊維娜 孫經武

陜西省咸陽市中心醫院心血管介入科 (咸陽 712000)

木犀草素預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應及細胞凋亡的影響

樊維娜 孫經武△

陜西省咸陽市中心醫院心血管介入科 (咸陽 712000)

目的：研究木犀草素預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷中細胞凋亡和炎癥反應的影響。方法：以30只健康雄性Wistar 大鼠為研究對象，隨機分為假手術組(A組)，缺血再灌注組(B組)，木犀草素組(C組)，每組10只，術前4d分別經尾靜脈注射給予相應處理。阻斷冠脈左前降支，構建心肌缺血模型，缺血30min后再灌注2h。用ELISA法檢測大鼠血清 TNF-α,IL-6的含量，采用TUNEL法檢測心肌細胞的凋亡指數。結果：與A組相比，B組心肌細胞凋亡指數、血清TNF-α及IL-6含量明顯上升(P<0.01)；與B組比較，C組的心肌細胞凋亡指數，血清IL-6和TNF-α的含量則顯著降低)(P<0.05或0.01)。結論：木犀草素預處理可以抑制心肌缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，其機制可能與減少促炎細胞因子TNF-α及IL-6的產生，進而減輕炎癥反應有關。

缺血性心肌病是世界性的一個復雜的心臟疾病，它的主要的和最常見的原因是造成管腔狹窄或閉塞的冠狀動脈粥樣硬化[1]，早期的再灌注治療是挽救瀕死組織的重要策略，但是再灌注本身也會對組織造成損傷，成為缺血再灌注損傷。其發生機制涉及活性氧的大量產生導致的蛋白質、脂質及染色體過氧化損傷，鈣離子超載，白細胞聚集，PH反常，ATP能量代謝障礙等。在這其中炎癥反應液發揮了重要作用，體現在許多促炎因子如TNF-a，IL-6，IL-1β的釋放，對組織造成損傷，嚴重的可導致細胞凋亡及壞死，因此抑制炎癥反應在一定程度上可以減輕心肌缺血再灌注損傷[2]。

木犀草素是一種可以在很多中國傳統醫藥中提取到的黃酮類化合物，既往研究表明其具有多方面的的顯著的生物學效應如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[3]。近年來關于其在缺血性疾病中的研究顯示其可以減輕腦缺血再灌注損傷[4]，也可以通過抗氧化作用進行心臟保護。但是目前尚無大鼠心肌缺血再灌注炎癥反應方面的研究報告。基于此種原因，我們借助大鼠模型，進一步探索木犀草素在心肌缺血再灌注損傷中發揮保護作用的機制，及該機制是否涉及炎癥反應及細胞凋亡。

1 資料與方法 1.1 實驗對象 以30只成年雄性Wister大鼠為研究模型，均重200±20g。

1.2 試 劑 木犀草素由陜西惠科植物開發有限公司提供，使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na)制成0.4%的懸浮液。TUNEL試劑盒(南京凱基生物公司)，TNF-α及IL-6 的ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物公司)。

1.3 方 法 1.3.1 實驗分組:將Wistar雄性大鼠按隨機數字表分為如下3組：假手術組(A組)，缺血再灌注組(B組)，木犀草素組(C組)，每組10只。按如下方案給藥：假手術組(A組)：大鼠每日經胃灌服0.5%CMC-Na1次，連續5d，劑量是10mL/(kg·d)，未經缺血再灌注處理。 缺血再灌注組(B組)：大鼠每日經胃灌服0.5%CMC-Na1次，連續5d，劑量是10mL/(kg·d)，5d后缺血30min，再灌注120min后取材。 木犀草素組(C組)：大鼠每日經胃灌服0.5%木犀草素1次，50mg/(kg·d)灌胃,余操作同B組。

1.3.2 模型建立:用20%烏拉坦對實驗大鼠實施腹腔注射麻醉(劑量9mL/kg)，連接并打開Medlab，連接肢體導聯心電圖, 頸部切開氣管，氣管插管行機械輔助通氣(通氣頻率60次/min，潮氣量20mL/kg)。在胸骨左緣0.4cm處開胸并進行肌肉分離操作后，切斷第4肋并將肋間肌分離，胸膜穿刺并分離心包膜, 擠出心臟。在左心耳下緣約4cm處進針，于肺動脈圓錐左緣出針，把一根聚乙烯管(直徑2mm)置于左前降支與結扎線間，用手拉緊結扎線促使聚乙烯管壓迫LAD造成冠脈血管急性閉塞，形成急性心肌缺血,在缺血30min后，取出聚乙烯管再灌注2h。觀察心電圖，以出現ST段顯著抬高為結扎成功標志，以缺血區心肌變紅、升高的ST段下降50%以上為再灌注成功的標志。A組的大鼠手術過程與B組相同，但只在心肌下穿線不結扎左前降支。

1.3.3 測定IL-6、TNF-α含量：灌注120min后，穿刺抽血3mL(經腹主動脈)，執行離心分離血清，參照TNF-α和IL-6試劑盒說明書，用酶聯免疫吸附法(ELISA)進行檢測。

1.3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡指數：再灌注120min后剪下心臟，分離左室心肌，放置在多聚甲醛(4%)固定12 h后石蠟包埋。依照說明進行檢測：石蠟切片脫蠟去水，1% Triton X-100透明液促滲，3%H2O2封閉液封閉內源性過氧化酶；滴加反應液；避光反應及轉化；顯色；蘇木精復染；脫水透明；封片鏡檢。陰性步驟同上，只是不滴加TdT。在光學顯微鏡下進行觀察，凋亡細胞核顏色為深淺不一的棕褐色，心肌細胞核如正常則呈藍色，切片缺血部位隨機選取10個高倍視野(×400 倍)，統計心肌細胞總數和凋亡細胞數。凋亡指數=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.4 統計學方法 運用SPSS 17.0統計軟件，用單因素方差分析的方法進行多組間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果 2.1 木犀草素對炎癥反應的影響 如表1所示，與A組相比，B組及C組促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的含量都明顯升高(P<0.01,P<0.05)；而與B組相比，C組TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.05)，差異有統計學意義。

表1 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量

注：與A組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與B組比較,◇P<0.05

2.2 木犀草素對大鼠心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的影響 如圖1及表2所示，TUNEL染色結果顯示，與A組相比，B組及C組心肌細胞凋亡指數明顯增加(P<0.01)；與B組相比，C組凋亡指數明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌組織AI比較

注：與A組比較,△P<0.01;與B組比較,▲P<0.01

圖1 各組大鼠心肌組織TUNEL染色(×400)

3 討 論 心肌缺血再灌注損傷嚴重影響著冠心病患者的臨床治療效果和預后，既往國內外研究發現心肌缺血再灌注損傷發生機制復雜，主要包括氧化應激、炎癥反應、白細胞聚集等，各種機制之間相互聯系，互為因果，最終導致心肌功能和結構障礙，導致心肌細胞凋亡與壞死。心肌細胞凋亡是其中最重要的原因之一。抑制心肌細胞凋亡可減少心肌缺血再灌注對心肌造成的損害。而木犀草素存在于許多中國傳統醫藥中，Shuai Zhang[4]等的研究顯示，木犀草素對腦缺血再灌注損傷發揮保護作用，其機制涉及抗氧化、抗凋亡、抗炎等方面。但目前國內外研究尚未見有對其在大鼠心肌缺血再灌注炎癥反應方面的研究報告。既往研究顯示炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷中發揮著重要的作用[5]，炎癥細胞的聚集和炎癥因子的釋放為關鍵步驟。在炎癥反應中，許多細胞因子得以釋放，包括TNF-a、IL-6、IL-8等，而這其中，TNF-a是觸發心肌缺血再灌注損傷炎癥反應的主要因子[6]，其是分子量為17kDa的可溶性多肽，由活化的巨噬細胞分泌，它可通過增加其他促炎細胞因子的釋放(如IL-6等)、增加細胞粘附分子的表達，影響中性粒細胞的聚集,并最終引起急性心肌組織損傷。另外TNF-a也可以誘導心肌細胞凋亡、參與血管重構、抑制心肌收縮，對心肌缺血再灌注心肌造成損害。因此抑制TNF-a的表達，在一定程度上可以抑制心肌缺血再灌注的炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用。

在本研究中，我們可以發現，與A組比較，B組和C組的心肌細胞凋亡指數均顯著增高；但與缺血組比較，藥物組的心肌細胞凋亡指數則顯著降低，說明木犀草素可以減輕心肌缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡損害。而與A組比較，B組的血清IL-6和TNF-α含量均明顯升高，說明缺血再灌注可以激活機體的炎癥反應；較之B組，C組的血清IL-6和TNF-α含量顯著下降，說明木犀草素可以抑制促炎因子TNF-α及IL-6的產生來減弱炎癥反應，減輕其帶來的炎癥損害。因此，抑制炎癥反應可能是木犀草素減少心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡，發揮保護作心肌用的機制之一。

總之，本研究發現木犀草素預處理可以抑制心肌缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，其機制可能與減少促炎細胞因子TNF-α及IL-6的產生，進而減輕炎癥反應有關。

[1] Mozaffari MS, Liu JY, Abebe W, et al. Mechanisms of load dependency of myocardial ischemia reperfusion injury[J]. Am J Cardiovasc Dis, 2013, 3:180-196.

[2] Wang C, Sun H, Song Y, et al. Pterostilbene attenuates inflammation in rat heart subjected to ischemia-reperfusion: role of TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(2):1737-1746.

[3] Yuan L, Wang J, Xiao H, et al, MAPK signaling pathwaysregulate mitochondrial-mediatedapoptosis induced by isoorientin in human hepatoblastoma cancer cells[J]. Food Chem Toxicol,2013, 53: 62-68.

[4] Zhang S, Qi Y, Xu Y, et al. Protective effect of flavonoid-rich extract from Rosa laevigata Michx on cerebral ischemia-reperfusion injury through suppression of apoptosis and inflammation[J].Neurochem Int,2013, 63(5): 522-532.

[5] 李 軍，石 博，黃可欣，等.葛根素對心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平的影響[J].中國實驗診斷學,2013, 17(4):631-633.

[6] 李健玲,陳兆霓,呂紀華. 玉郎傘皂苷對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(9):250-251.

(收稿2015-07-09；修回2015-08-02)

Effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion injury in rats

Fan Weina Sun Jingwu

Department of Cardiovascular Interventional Division, Center Hospital in Xianyang City (Xianyang 712000)

Objective:To detective the effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion(I/R) injury in rats. Method: Male wistar rats were randomly allocated into three groups: sham group (group A), I/R group (group B), luteolin group (Group C), with 10 rats in each group, 4 days before operation were injected via the tail vein giving corresponding treatment. The rats model of myocardial ischemia reperfusion (MI/R) injury was induced by a transient vessel occlusion for 30 min and reperfusion for 2h. The contents of, IL-6 and TNF- were detected by ELISA, and apoptosis index of myocardial cells was detected by TUNEL method. Resuls Compared to group A, group B， myocardial apoptosis index, serum TNF-α and IL-6 levels increased significantly (P<0.01).Results: Compared to group B, serum TNF-α and IL-6 levels and myocardial apoptosis index in group C were significantly lower (P<0.01 or 0.05). Conclusion: Luteolin pretreatment have protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rats, the mechanism of it may be through down-regulated TNF-α and IL-10 expression to reduce inflammation and inhibit myocardium apoptosis.

Myocardial reperfusion injury/ traditional Chinese medicine therapy Resedaceae/therapeutic uses Animal experimentation Apoptosis

心肌再灌注損傷/中醫藥療法 木犀草科/治療應用 動物實驗 細胞凋亡

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.050

△山東省濱州醫學院煙臺附屬醫院心內科(煙臺264100)