慢性中耳炎及膽脂瘤中細菌生物膜的觀察

西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科病院(西安710004)

王 冰 成 穎 許 珉▲

▲通訊作者

慢性中耳炎及膽脂瘤中細菌生物膜的觀察

西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科病院(西安710004)

王 冰 成 穎 許 珉▲

目的：通過掃描電子顯微鏡觀察慢性化膿性中耳炎、分泌性中耳炎及中耳膽脂瘤中耳腔病變組織中細菌生物膜存在情況。方法：收集手術治療慢性化膿性中耳炎11例,分泌性中耳炎8例,中耳膽脂瘤9例,術中中耳腔內病變組織為實驗標本(其中肉芽組織11例、分泌液8例、膽脂瘤9例)；所得標本進行掃描電子顯微鏡觀察其細菌生物膜存在情況。結果：肉芽組織、膽脂瘤中細菌生物膜檢出率較高,分泌性中耳炎中稍低；近6個月有流膿病史者檢出率低于近6個月無流膿病史者；膽脂瘤伴感染者檢出率遠高于不伴感染者。結論：細菌生物膜確存在于慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤，慢性分泌性中耳炎存在率相對較低；這可能是導致抗生素耐藥、病情遷延不愈或反復急性發作的原因。

細菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)是細菌自行集合的多細胞復合體，由細菌和自身及宿主共同分泌的細胞外多糖機制共同組成[1]，主要通過對抗機體免疫及產生抗生素耐藥等機制導致慢性感染的遷延不愈或反復急性發作。目前認為99%的細菌以生物膜的形式存在，美國疾病控制與預防中心估計至少65%的人類細菌感染與生物膜有關[2]。在耳鼻咽喉相關疾病中,已有研究表明慢性扁桃體炎、腺樣體炎、慢性鼻-鼻竇炎、中耳炎、膽脂瘤及耳科植入器械等均與細菌生物膜有關[3]。然而,而慢性化膿性中耳炎(CSOM)和慢性分泌性中耳炎(COME),中耳膽脂瘤,細菌生物膜研究較少。本實驗通過掃描電子顯微鏡(SEM)對慢性中耳炎、膽脂瘤中耳腔中細菌生物膜的存在情況進行觀察,了解其分布差異性。

對象與方法

1 對 象 慢性化膿性中耳炎11例，膽脂瘤9例，分泌性中耳炎8例，術中取鼓竇乳突腔或上鼓室病變組織(11例肉芽組織、9例膽脂瘤、8例分泌液)為實驗標本。慢性化膿性中耳炎組根據近6月有無流膿病史分為兩個亞組，膽脂瘤組根據是否伴發感染分為兩個亞組。

2 方 法 術中所得標本立即置于2.5%戊二醛固定,依次用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇浸泡,梯度脫水，每次5min,脫水后依次放入30%、50%、70%的醋酸異戊酯液中浸泡各10min,后置于100%醋酸異戊酯中20min充分置換,在體積分數100%二氧化碳氣體中臨界干燥1h,離子濺射表面固定鍍膜,所得標本進行SEM觀察。

3 掃描電鏡結果判定 掃描電鏡下同時觀察到以下三個證據即認為存在細菌生物膜：①細菌大小及形態的物質；②連接于細菌球之間的不定形的多糖組織；③附著于組織表面[4]。

結 果

掃描電鏡下,可見大面積聚集細菌及連接于細菌之間的纖維樣組織(圖1、4),即認為大量生物膜存在；如僅局部可見細菌及纖維樣組織,或纖維樣組織極其稀薄(圖2、5),即認為存在少許細菌生物膜；如組織表面光滑(圖3、7)或組織表面僅可見少許散在細菌無纖維樣組織(圖6、9)即認為無細菌生物膜存在。前兩者均被認定為在組織中觀察到細菌生物膜。

圖1 掃描電鏡下可見大量細菌聚集，有纖維樣組織連接于細菌之間，箭頭所指為纖維狀物(2000×)；圖2 掃描電鏡下可見散在細菌生物膜，其余組織表面光滑(5000×)；圖3 肉芽組織表面光滑，未見細菌或生物膜，箭頭所指為肉芽組織(3000×)。

圖4 掃描電鏡下可見膽脂瘤表面大量細菌聚集，大量纖維樣物連接于細菌之間，箭頭所指為細菌(4000×)；圖5 膽脂瘤表面可見少許纖維樣物連接于細菌之間，箭頭所指為纖維樣物(1500×)；圖6 膽脂瘤表面可見散在細菌分布，未見細菌生物膜，箭頭所指為細菌，星號標記為膽脂瘤角化物(1000×)。

圖7 分泌液表面可見大量纖維樣物附著，其間可見細菌聚集，箭頭所指為纖維物(2500×)；圖8 可見散在細菌被細胞外多糖基質包裹，箭頭所指為細胞外多糖基質(5000×)；圖9 分泌液表面僅可見數個散在細菌，箭頭所指為細菌(4000×)。

慢性化膿性中耳炎組11例中有8例觀察到細菌生物膜，檢出率8/11(72.7%)，膽脂瘤組9例6例觀察到細菌生物膜，檢出率6/9(66.7%)，分泌性中耳炎組8例中4例觀察到細菌生物膜，檢出率4/8(50%)。慢性化膿性中耳炎亞組中，近6月有流膿病史者8例中5例檢出，檢出率5/8(62.5%)；停止流膿超過6月者3例，均觀察到大量細菌生物膜，檢出率100%。膽脂瘤亞組中，膽脂瘤伴發感染者6例中5例觀察到細菌生物膜，檢出率5/6(83.3%)；膽脂瘤不伴感染者3例中僅1例觀察到少許細菌生物膜，檢出率1/3(33.3%)。(見附表)。

附表 不同類型中耳炎細菌生物膜檢出率表

討 論

本實驗結果支持細菌生物膜在耳鼻咽喉疾病中發揮重要作用這一假設，我們的實驗結果中，慢性化膿性中耳炎組11例中有8例觀察到細菌生物膜，檢出率8/11(72.7%)，膽脂瘤組9例6例觀察到細菌生物膜，檢出率6/9(66.7%)。這一結果與國外學者研究較為接近，Lee等[5]對CSOM患者中耳粘膜BF檢出率為6/10(60%)；Chole等[6]發現膽脂瘤患者BF檢出率為16/24(66.7%)，動物模型中膽脂瘤BF檢出率為21/24(87.5%)；Kaya等[7]在其研究中發現CSOM的細菌生物膜存在率為7/10(70%)，膽脂瘤中存在率為8/13(61.5%)；Gu等[8]研究中發現CSOM細菌生物膜檢出率92%，膽脂瘤組為85%。根據以上結果，有學者提出細菌生物膜可能是慢性中耳炎致病的重要因素之一，這可解釋嚴重的抗生素耐藥問題，Mah等[9]認為，處于細菌生物膜里層的細菌對環境變化多不敏感，尤其是對抗菌藥物的敏感性顯著降低。Schauder等[10]發現處于細菌生物膜內層的細菌對抗生素完全不敏感，這使感染反復發作，難以控制，同時長期低效度的抗生素環境使得內層菌變異而產生耐藥性。而細菌生物膜與損傷部位的結合導致炎癥遷延不愈。

慢性分泌性中耳炎組8例中4例觀察到細菌生物膜，檢出率4/8(50%)，而國外學者報道分泌性中耳炎患者中耳腔粘膜細菌生物膜檢出率均較本實驗結果高：Pinar等[11]在OME患兒中耳粘膜發現BF檢出率為46/50(92%)；Hall-Stoodley等[12]在16例細菌培養陽性的OME中耳粘膜中BF檢出率為9/16(56.3%)。出現實驗結果差異較大可能與取材部位及檢測手段有關。而在慢性化膿性中耳炎兩個亞組中，停止流膿半年以上者3例中均觀察到大量典型細菌生物膜，而近6個月有流膿病史者細菌生物膜檢出率較低，Kaya等[7]發現CSOM檢出率為70%而慢性非化膿性中耳炎檢出率為54.5%；Akyildiz等[13]通過直接顯微鏡和透射顯微鏡觀察中耳腔粘膜細菌生物膜，結果顯示近期有耳漏癥狀組細菌生物膜存在率明顯高于無耳漏組，而無耳漏組與對照組人工耳蝸移植組并無明顯統計學意義。這一結果與本實驗結果相差較大，考慮為本實驗取材為炎癥較重的肉芽組織，并且應用相對認可的掃描電子顯微鏡觀察。本實驗結果與BF的生物學行為一致。BF處于相對穩定狀態時，病變組織內細菌以生物膜方式存在，疾病處于靜止期，而當身體抵抗力下降或遭受外來感染時，生物膜這個三維立體的結構中細菌飽和，在密度感應系統及其他因素影響下，釋放一部分細菌，形成感染的急性發作，浮游菌遇到適宜表面繼續附著、發展、成熟，形成循環往復[14]。中耳膽脂瘤兩個亞組中伴發感染組細菌生物膜檢出率高，不伴發感染組僅1例觀察到少許纖維樣組織包裹細菌球，Saunders等[15]在其研究中也發現不伴發感染的膽脂瘤幾乎未發現細菌生物膜，而伴發感染或急性發作的膽脂瘤細菌生物膜存在率極高，甚至鱗狀上皮表面亦可觀察到。

結論：我們的實驗結果支持細菌生物膜存在于慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤及慢性分泌性中耳炎這一假設，認為細菌生物膜在不同類型的慢性中耳炎中存在較為普遍，而慢性分泌性中耳炎中細菌生物膜存在相對較低，這可能是導致抗生素耐藥、病情遷延不愈或反復急性發作的原因。

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(收稿：2014-09-28)

中耳炎 伴滲出液中耳炎 中耳炎,化膿性 膽脂瘤 細菌 生物膜 顯微鏡檢查,電子

R764.21

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.007