Survivin和Bcl-2基因靶向siRNA對舌癌Tca-8113細胞生長抑制及誘導凋亡作用的影響*

西安交通大學口腔醫(yī)院醫(yī)學研究中心(西安710004)

饒國洲 石建峰 王欣欣 魏 虹 李 昂 孫惠玲 張引成

Survivin和Bcl-2基因靶向siRNA對舌癌Tca-8113細胞生長抑制及誘導凋亡作用的影響*

西安交通大學口腔醫(yī)院醫(yī)學研究中心(西安710004)

饒國洲 石建峰 王欣欣 魏 虹 李 昂 孫惠玲 張引成

目的：探討Survivin聯(lián)合Bcl-2 siRNA對舌癌細胞的誘導凋亡作用。方法：實驗分空白組、脂質體組、陰性干擾組、Survivin干擾組、bcl-2干擾組、Survivin/ bcl-2干擾組，以舌癌細胞系Tca-8113為研究對象，應用小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)分別和同時沉默下調Survivin和Bcl-2兩種基因的表達，采用MTT檢測細胞增殖抑制作用，流式細胞儀檢測細胞凋亡，透射電鏡檢測細胞超微結構變化，比較各組對腫瘤細胞生長的抑制及誘導凋亡作用。結果：轉染24h后可見Survivin/ bcl-2干擾組的細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，體積縮小變圓，染色質濃集于核膜內側，核碎裂，電鏡下呈典型的細胞凋亡形態(tài)學改變，并有凋亡小體出現(xiàn)，MTT顯示細胞生長明顯抑制，MCF檢測凋亡率分別為空白組0.85%、脂質體組2.46%、陰性干擾組3.06%、Survivin干擾組15.48%、bcl-2干擾組11.02%、Survivin/ bcl-2干擾組29.18%，與空白組相比差異有統(tǒng)計學顯著性意義(P<0.01)，轉染陰性siRNA及脂質體組無抑制和誘導凋亡作用，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論： 靶向特異性Survivin聯(lián)合Bcl-2 siRNA雙基因沉默下調較單基因沉默下調作用顯著增強，并且能有效抑制舌癌細胞的增殖及誘導其發(fā)生凋亡。

研究表明[1-2]，siRNA可介導哺乳動物細胞特異性基因沉默，具有高效性和特異性,已成為基因功能研究和腫瘤基因治療的新技術。本研究通過RNA干擾使舌癌細胞Survivin、bcl-2基因共沉默，同時與單一RNA干擾Survivin基因和bcl-2基因進行比較研究,觀察轉染后舌癌Tca-8113細胞的Survivin和bcl-2基因的表達,以及腫瘤細胞的生物學行為變化，探討RNAi后的協(xié)同效果及作用機制和對舌癌細胞增殖凋亡的影響,以期為舌癌的基因治療和其他相關的腫瘤生物治療探索更加有效的治療方案。

材料與方法

1 材 料 細胞株及RNA干擾載體：人舌癌Tca-8113細胞株(由本實驗室保存)，應用含10g/dl小牛血清和100μg/ml雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)；Survivin shRNA，Bcl-2 shRNA(由本室構建)；酶標分析儀(Amersham)；流式細胞儀(BD)；透射電鏡(日立)；恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)；臺式離心機(Sigma)；熒光倒置顯微鏡(Nikon)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclon)；小牛血清(Gibco)；MTT(Amresco)；脂質體(Invitrogen)。

2 方 法 ①siRNA載體轉染細胞：細胞數(shù)調成1×105接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞生長至80%時轉染。用無血清培養(yǎng)基稀釋質粒DNA至100μl混勻，同時稀釋6μl脂質體至100μl，兩液混勻，室溫放置20 min。轉染前用無血清培養(yǎng)基漂洗細胞數(shù)次，將800μl 無血清培養(yǎng)基緩慢加入以上混合液混勻，加入培養(yǎng)細胞中，37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。5h后補加20%小牛血清的完全培養(yǎng)基。②MTT檢測：轉染細胞分為6組，每組設6個復孔，以1×107細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，分別于轉染后12、24、48、72h在酶標儀上570nm波長處檢測各孔A值。抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100% 。③流式細胞儀檢測：將各組細胞用0.25%胰酶消化離心收集，細胞數(shù)1×106個，用PBS洗2次，加入100μl Binding Buffer和10μl FITC熒光標記的AnnexinV(20μg/ml)，室溫避光30min，加5μl PI(50μg/ml)，避光反應5min后，加入400μl Binding Buffer。同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作陰性對照，立即上流式細胞儀檢測。④透射電鏡觀察：收集各組轉染后細胞數(shù)大于1×106個，用PBS洗2次后3%戊二醛固定，PBS洗2次，再用1%鋨酸固定，丙酮酸梯度脫水。細胞經包埋后超薄切片染色，透射電鏡觀察。

結 果

1 RNAi載體成功轉染Tca-8113細胞 將帶紅色熒光表達蛋白的Bcl-2 RNAi載體和帶綠色熒光表達蛋白的Survivin RNAi載體分別轉染到Tca-8113細胞中，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察到在同一個細胞內出現(xiàn)紅色和綠色熒光，表明靶向特異性Survivin/ Bcl-2雙基因轉染成功。見圖1。

(A:Bcl-2shRNA;B:Survivin shRNA;C:Survivin/Bcl-2shRNA)

2 倒置顯微鏡下細胞學形態(tài) 轉染前Tca-8113細胞呈鋪路石樣生長，細胞完整、輪廓清晰，增殖旺盛，轉染后Tca-8113細胞形態(tài)發(fā)生改變，體積縮小變圓，染色質濃集于核膜內側，核碎裂，細胞生長明顯抑制。見圖2。

(A：轉染前Tca-8113細胞;B：轉染后Tca-8113細胞)

3 MTT檢測結果 經脂質體介導轉染后，分別于培養(yǎng)12、24、48、72h收集細胞，采用MTT檢測細胞增值抑制作用，結果顯示沉默bcl-2后抑制率分別為9.1%、20.6%、29.8%、35.4%，沉默survivin后抑制率分別為13.6%、29.4%、36.2%、43.08%，沉默bcl-2/survivin后抑制率分別為18.2%、35.3%、44.7%、56.9%。各干擾組細胞增值能力與對照組相比受到明細抑制，差異均有統(tǒng)計學顯著性意義(P<0.01)，各干擾組間細胞增值能力比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，轉染陰性siRNA及脂質體組無抑制作用，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果顯示，隨培養(yǎng)和 RNA干擾作用時間的延長，細胞的生長抑制呈時間依賴性。見圖3。

4 流式細胞儀分析顯示 Tca-8113細胞經轉染24h后，空白組、脂質體組、陰性對照組、Survivin 干擾組、Bcl-2干擾組、Survivin/ Bcl-2干擾組，凋亡率分別為0.85%、2.46%、3.06%、15.48%、11.02%及29.18%，RNA干擾組與對照組相比差異有統(tǒng)計學顯著性意義(P<0.01)，雙基因沉默組較單基因沉默組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，轉染陰性shRNA、脂質體及空白對照組無誘導凋亡作用，各組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

5 透射電鏡檢測結果 轉染脂質體和陰性對照及空白對照的Tca-8113細胞包膜完整，胞核圓形或不規(guī)則，核仁大而明顯，細胞核內染色質分布不均，未見到凋亡細胞及凋亡小體。轉染靶向Survivin及 Bcl-2 siRNA的Tca-8113細胞核內染色質團塊狀凝聚、邊集，呈現(xiàn)出凋亡細胞的形態(tài)學改變，細胞核染色質高度凝集的凋亡細胞，其核內形成高電子密度的團塊，且核膜缺損，核碎裂后分散在細胞突起內，部分突起與細胞分離，形成凋亡小體。見圖5。

圖3 不同干擾組對Tca-8113細胞增值抑制作用的影響

(A:空白對照組；B:脂質體對照組；C:陰性對照組；D:Survivin干擾組；E：Bcl-2干擾組；F：Survivin/Bcl-2干擾組)

(A：轉染前Tca-8113細胞;B：轉染后細胞核內形成凋亡小體)

討 論

Survivin基因或 BIRC5又稱生物存活素，屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)，具有抑制細胞凋亡和調節(jié)細胞分裂的雙重功能，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制基因[3]，其在正常組織中幾乎不表達，但在所有惡性腫瘤中均有明顯表達。bcl-2是研究最深入的凋亡調控基因之一[4]，能延長細胞壽命，但對細胞周期和分化不產生影響，bcl-2高表達能阻抑多種凋亡誘導因素如射線、化學藥物等所引發(fā)的細胞凋亡。bcl-2基因在乳腺癌、卵巢癌、以及胃腺癌等多種人類腫瘤細胞中都顯著升高。近些年這來兩種基因倍受腫瘤研究領域廣泛關注，目前對Survivin和Bcl-2在舌鱗癌中的表達已有較深入的研究及報道。

徐亞娟等[5]， Survivin蛋白在舌鱗癌組織中表達陽性率為56.3%，癌旁組織中陽性表達為25.0%，正常舌粘膜中表達陰性。王智明等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)， Survivin與Bcl-2在舌鱗癌組織中蛋白表達陽性率分別為68.9%和60.0%，正常舌粘膜中陰性表達。并且隨著細胞分化程度越低陽性表達率越高，有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的兩者之間差異顯著。籍麗莉[8]報道，Survivin在口腔鱗癌組織中表達陽性率高達88.89%，正常組織中無表達。

以上研究表明了Survivin和Bcl-2在口腔鱗癌組織中表達兩者成正相關性， Survivin和Bcl-2的異常表達與舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，表明Survivin單獨或協(xié)同bcl-2發(fā)揮了抗凋亡作用，也證明了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與多個基因相互作用相關。提示靶向 Survivin和Bcl-2 RNA干擾治療口腔鱗癌的可行性。

目前，應用RNA干擾技術在腫瘤細胞中沉默單個基因的表達研究已有較多文獻報道，同時沉默兩種基因的表達報道較少，尤其在舌癌細胞系Tca-8113細胞中干擾沉默下調兩個凋亡抑制基因的表達還未見報道。本研究在前期的工作中已成功構建了Survivin和Bcl-2慢病毒RNA干擾載體，并篩選出最佳干擾序列。在本研究中，通過脂質體介導分別轉染siRNA到Tca-8113細胞中，沉默下調Survivin、bcl-2基因的表達，觀察到舌癌細胞生長增殖明顯減慢和抑制，細胞縮小變圓、數(shù)量減少及出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，在電鏡下細胞核內可見明顯的凋亡小體。這種抑制和凋亡程度隨干擾時間的延長而增加，且具有時間依賴性。在實驗中發(fā)現(xiàn)沉默Survivin基因誘導凋亡作用高于沉默bcl-2基因，顯示出Survivin基因抑制凋亡作用強于bcl-2基因的作用，雙基因沉默下調較單基因沉默下調細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，RNA干擾組的細胞增殖抑制率和細胞凋亡率與對照組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性意義(P<0.01)。由于Survivin和Bcl-2分別作用于凋亡通路的不同位點對凋亡抑制產生協(xié)同作用。推測當靶向特異性siRNA轉染細胞時，沉默下調了Survivin和Bcl-2基因的表達，解除了Survivin直接抑制caspase蛋白酶的作用，和抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7的活性或干擾caspase-9的活性，以及各種刺激誘導的下游細胞凋亡的共同通路[9]。同時解除了bcl-2通過干擾細胞色素C自線粒體釋放，而阻斷caspase蛋白酶的激活[10]，從而誘導細胞發(fā)生凋亡。蔡明等[11]報道，沉默單基因的凋亡作用較同時沉默兩種基因的效果好，認為沉默兩種作用于共同凋亡通路的基因，相互存在競爭和抑制作用導致其聯(lián)合沉默作用的降低。由于本研究沉默的Survivin和Bcl-2基因抑制凋亡途經及作用凋亡通路的位點有所不同，本研究觀察到聯(lián)合沉默雙基因具有協(xié)同誘導凋亡作用。在本研究中除沉默下調Survivin和Bcl-2基因以外，可能還有多種基因參與誘導凋亡作用有關，如caspase、P53、P21、Bax等，有待于更深入的研究。

舌癌是口腔頜面部發(fā)病率最高的鱗狀細胞癌，其惡性程度非常高，由于舌的解剖和功能特點，早期即發(fā)生頸淋巴結轉移。目前舌癌是以手術為主的綜合治療，如能采取其他有效的治療方法控制早期癌變，臨近亞病灶、微小病灶及轉移病灶的發(fā)展，則可以減少手術切除范圍，提高患者生存質量，而晚期舌癌手術治療困難，臨床中多采用放、化療，由于腫瘤細胞對放、化療的不敏感性及耐藥性，往往治療效果不佳。本實驗結果表明，聯(lián)合沉默Survivin和Bcl-2兩種抗凋亡基因的表達，其對細胞的生長增值抑制和誘導凋亡作用強于沉默單基因的作用，這種協(xié)同作用和效果有助于腫瘤細胞對放、化療敏感性的增加及降低耐藥性，有助于更深入了解Survivin和Bcl-2 siRNA的作用機制及其在腫瘤基因治療中的作用，為臨床舌癌的治療提供實驗依據(jù)。

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(收稿：2014-08-19)

致 作 者

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陜西醫(yī)學、陜西中醫(yī)雜志社

*陜西省社發(fā)攻關項目(2009K12-01)

舌腫瘤 RNA干擾 基因, bcl-2 細胞凋亡 @Survivin基因 @Tca-8113細胞

R379.36

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.004