鈉尿肽分子的人工改造及其舒血管功能的評價*

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實驗室(西安710038)

于 軍 鐵 茹 王建榜 張學(xué)策 常 盼 朱妙章▲

鈉尿肽分子的人工改造及其舒血管功能的評價*

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實驗室(西安710038)

于 軍 鐵 茹 王建榜 張學(xué)策 常 盼 朱妙章▲

目的：對天然的鈉尿肽(NPs)分子進(jìn)行改造，并比較新型NPs分子的舒血管效應(yīng)。方法：根據(jù)天然NPs的構(gòu)效關(guān)系,人工設(shè)計合成了7種新型的NPs分子：CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC。進(jìn)而采用離體血管灌流實驗評價新型NPs的血管舒張活性,并與天然鈉尿肽ANP、BNP、CNP進(jìn)行比較。結(jié)果：血管舒張活性排序為：CNP>CNAAC>BNAAC>BNBAC>ANCAC>ANP>BNP>ANBAC>BNCAC>CNBAC。結(jié)論：新型設(shè)計的NPs具有其親本分子的活性,可能成為治療心血管疾病的新型候選藥物。

鈉尿肽(NPs)是一個結(jié)構(gòu)相似但基因不同的肽類家族，包括心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉尿肽(BNP)、C型鈉尿肽(CNP)、樹眼鏡蛇利尿鈉肽(DNP)和尿鈉素(URO)等。它們在維持心血管和腎臟的穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要的角色[1-2]。NPs結(jié)構(gòu)中具有一個由兩個Cys通過二硫鍵形成的17個氨基酸的環(huán)形結(jié)構(gòu)域和兩個游離的末端序列(CNP只有N末端)(附圖)。研究表明，NPs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是其與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮舒張血管作用的重要活性中心，而兩個游離的末端主要起排鈉和利尿的作用[3]。本研究依據(jù)天然NPs的構(gòu)效關(guān)系，將鈉尿肽分子的N末端頭部、二硫鍵連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以及C末端尾部進(jìn)行組合設(shè)計，進(jìn)而比較所獲得新型鈉尿肽分子的舒血管活性,旨在獲得新型候選藥物。

材料與方法

1 材 料 CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC、ANP、BNP和CNP均由江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院提供。NE(去甲腎上腺素)和Ach(乙酰膽堿)系美國Sigma 公司產(chǎn)品。雄性SD大鼠(體質(zhì)量250～350 g,6～8周齡)在室溫為( 23±1 ) °C、相對濕度為60 %～70 %的環(huán)境下飼養(yǎng)，每天6:00至18:00給予光照。整個實驗階段,大鼠在標(biāo)準(zhǔn)的實驗室清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，并給予自由飲食飲水。

2 方 法 ①鈉尿肽分子的人工設(shè)計與合成：依據(jù)天然NPs的構(gòu)效關(guān)系，將鈉尿肽分子的N末端頭部、二硫鍵連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以及C末端尾部進(jìn)行組合設(shè)計，確定新型鈉尿肽分子的一級結(jié)構(gòu)。采用固相化學(xué)法合成鈉尿肽分子。②腹主動脈環(huán)制備及舒血管活性測定：正常SD大鼠5只經(jīng)腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，剪取腹主動脈，置于盛有冷的Krebs 液(mmol/L:115 NaCl，4.7 KCl，25 NaHCO3，1.2 MgCl2,1.2 KH2PO4,2.5 CaCl2,10 %葡萄糖；pH 7.4)中,去掉血管表面結(jié)締組織,制備成3 mm長的血管環(huán)。其中一半血管環(huán)用浸有對照液的棉花拭子輕輕摩擦內(nèi)皮表面以去除內(nèi)皮。將血管環(huán)懸掛于盛有37 °C Krebs液的浴槽中,通入含95 % O2和5 % CO2的混合氣體[4],連接張力傳感器。重復(fù)給予0.1 mol/L KCl,以每次100mg遞增直至找到最佳基礎(chǔ)張力為500mg,用于后面的藥理學(xué)實驗。經(jīng)平衡30 min后,用Ach (10-6mol/L )對經(jīng)過NE (10-6mol/L )預(yù)收縮的血管環(huán)是否產(chǎn)生舒張效應(yīng)判斷血管內(nèi)皮活性。然后反復(fù)沖洗使血管張力恢復(fù)至基線,穩(wěn)定30 min后重復(fù)給予NE (10-6mol/L ),使血管環(huán)收縮達(dá)穩(wěn)定值(80 %最大收縮幅度),分別逐漸增加CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC、ANP、BNP和CNP的濃度(10-10～10-6mol/L)，以制作累積濃度-舒張反應(yīng)曲線,求出最大舒張反應(yīng)值(Emax)。

結(jié) 果

1 新型鈉尿肽分子的獲得 見附圖，附表。鈉尿肽家族(ANP、BNP、CNP、DNP和URO)的氨基酸序列及活性結(jié)共同點為：具有N端頭部、二硫鍵連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以及C端的尾部。CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC均為嵌合體的鈉尿肽分子，其中CNAAC和BNAAC以ANP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為核心，分別嵌合CNP的N端、BNP的N端以及ANP的C端。BNBAC、ANBAC和CNBAC以BNP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為核心，分別嵌合BNP的N端、ANP的N端、CNP的N端，以及ANP的C端。ANCAC、BNCAC以CNP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為核心，分別嵌合ANP的N端、BNP的N端，以及ANP的C端。CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC從結(jié)構(gòu)上看，天然鈉尿肽ANP、BNP、CNP是CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的“雙親”，而CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC則是“兄弟”關(guān)系。考慮到CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC與天然鈉尿肽結(jié)構(gòu)上的相似性，我們進(jìn)一步比較研究了CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC與ANP、BNP、CNP的舒血管活性。

附圖 鈉尿肽家族(ANP、BNP、CNP、DNP和URO)的氨基酸序列及活性結(jié)構(gòu)示意圖

附表 鈉尿肽擴張血管活性的比較(n=5)

討 論

目前，對NPs分子的改造主要集中在其尾部的重新組合上，已有血管鈉肽(Vasonatrin peptide, VNP)、CD-NP、CU-NP、CUB-NP、CAA-NP、BUA-NP、BAA-NP等，均為采用天然NPs的環(huán)狀頭部和尾部重新組合而成，統(tǒng)稱為嵌合體鈉尿肽(chimeric/designer natriuretic peptide)[5-7]。這種改構(gòu)模式是基于NPs的環(huán)形結(jié)構(gòu)域和游離末端功能的獨立性，以及互相之間對構(gòu)象形成不干擾的假設(shè)下進(jìn)行的，希望獲得高生物活性的新NPs分子。

本研究根據(jù)天然鈉尿肽分子的構(gòu)效關(guān)系，采用“頭”、“尾”和“環(huán)”組合的方式，設(shè)計合成了多種嵌合體鈉尿肽分子。這些新鈉尿肽分別包含其親本的17個氨基酸組成的環(huán)結(jié)構(gòu)及C末端和N末端。這些不同結(jié)構(gòu)的嵌合體利尿鈉肽鈉尿肽實驗結(jié)果說明：①NPs分子的環(huán)形結(jié)構(gòu)域和游離末端在功能上雖有一定的獨立性，但結(jié)構(gòu)上存在互為影響的因素；②保留某一NPs成員的分子完整性再疊加尾部的基于功能結(jié)構(gòu)域的設(shè)計方案是行之有效的。設(shè)計合成新型鈉尿肽嵌合體，以優(yōu)化鈉尿肽結(jié)構(gòu)對于鈉尿肽的臨床應(yīng)用是可行的策略。

綜上所述，作為新型人工合成的鈉尿肽，CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的舒血管效應(yīng)提示他們可能成為治療高血壓的新型候選藥物。目前，我們只對CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的擴血管活性進(jìn)行了比較檢測，但其心腎活性及機制還有待于進(jìn)一步研究。

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(收稿：2014-07-31)

致 作 者

根據(jù)國家數(shù)字書寫規(guī)范GB/T15835～1985《關(guān)于出版物上數(shù)字用法的規(guī)定》要求，今后凡投本刊的文稿須規(guī)范書寫。如公歷世紀(jì)、年代、月、日、時刻和計數(shù)、計量均用阿拉伯?dāng)?shù)字；小數(shù)點前或后3位數(shù)字時，每3位數(shù)字一組，組間空1/4漢字空，如“1，329．112，6”應(yīng)寫成1 329．112 6；但序數(shù)詞和年份、頁數(shù)、部隊番號、儀表型號、標(biāo)準(zhǔn)號不分節(jié)；百分?jǐn)?shù)的范圍和偏差，前1個數(shù)字的百分符號不能省略，如6%～88%不能寫成6～88%，30．5%±11．2%不能寫成30．5±11．2%。另附帶尺寸單位的數(shù)值相乘，按下列方式書寫：3cm×4cm×5cm不能寫成3×4×5cm3。

陜西醫(yī)學(xué)、陜西中醫(yī)雜志社

Artificial modification and vasorelaxing functional evaluation of natiuretic peptides

Central Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical University (Xi’an 710038)

Yu Jun Tie Ru Wang Jianbang et al

Objective：To modify the structure and evaluate the vasorelaxing function of natriuretic peptides. Methods：According to the structure-activity relationship of natural natriuretic peptides (NPs), 7 kinds of novel NPs (CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC) were artificially designed and engineered. Furthermore, perfusion experiments of in vitro blood vessels were performed to evaluate the vasorelaxing effects of these novel NPs, compared with the natural NPs including atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), and C type natriuretic peptide(CNP).Results：Vasorelaxing effects were ranked as: CNP>CNAAC>BNAAC>BNBAC>ANCAC>ANP>BNP>ANBAC>BNCAC>CNBAC.Conclusion：Innovative designed NPs have the activity of their parent molecules, and might be new candidate drugs against cardiovascular diseases.

Natriuretic peptides Molecular structure Combinatorial chemistry techniques Vasodilation

*國家自然科學(xué)基金項目(81270329,31271220,81300190,81470438)

陜西省自然科學(xué)基金項目(2010JM4050,2014JM4166)

▲通訊作者：第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室

促尿鈉排泄肽類 分子結(jié)構(gòu) 組合化學(xué)技術(shù) 血管舒張

R914.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.003

國家新藥創(chuàng)制重大科技專項(2009ZX09103-671)