高效液相色譜法測定土茯苓中落新婦苷、阿魏酸、白藜蘆醇含量

2015-03-22 03:16:17孫兢喆沈陽市第二中醫醫院沈陽110100

陜西中醫 2015年1期

孫兢喆沈陽市第二中醫醫院 (沈陽 110100)

·方藥縱橫·

孫兢喆沈陽市第二中醫醫院 (沈陽 110100)

目的：確立土茯苓藥材中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇三種指標成分的含量。方法：應用高效液相色譜法(HPLC)測定，色譜條件為ODS-C18色譜柱(5μm，150x4.6mm)，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min，測定波長290 nm。結果：阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇分別在0.02088～0.1044 ug、0.4284～2.142 ug、0.0432～0.216ug范圍內線性關系良好；樣品中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇評價含量分別為0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。結論：該方法操作簡單、準確，可作為土茯苓質量控制方法。

土茯苓來源是百合科植物光葉菝葜(SmilaxglabraRoxb)的干燥根莖，始載于《名醫別錄》名禹余糧，《本草綱目》始稱土茯苓。近年來有關土茯苓對心血管系統、利尿、抗炎、抑菌及解毒等方面藥理作用研究較多[1]；臨床中多用來治療慢性胃炎、急性睪丸炎、滴蟲性陰道炎、梅毒、咳喘、流行性腮腺炎和小兒疳積[2，3]；在成分測定方面，多以落新婦苷或白藜蘆醇為指標建立相應高效液相色譜法(HPLC)檢測方法[4-9]。我國頒布的藥典中，僅對土茯苓中的落新婦苷進行含量測定，并為優化土茯苓質量評價的方法，本試驗采用HPLC法測定本藥阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥 1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)，超聲波提取器(AS3120A，上海)，電熱恒溫鼓風干燥箱(GZX-GF40X45，上海)，電子天平(ALC-110.4，上海)。

1.2 試劑液相用水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品(成都曼思特公司)，液相色譜歸一化法測定三種對照品純度均大于99.0%。土茯苓飲片于2014年2月采購自安徽亳州藥材交易中心，10個批次的產地分別為：安徽(新興中藥廠)、浙江(黃巖醫藥藥材有限公司)、江西(雙華中藥飲片廠)、福建(市宏發中藥材有限公司)、湖南(同仁堂飲片廠)、湖北(協和堂飲片廠)、廣東(廣印堂飲片廠)、廣西(永剛飲片廠)、四川(方敏飲片廠)、云南(滬譙飲片廠)，經遼寧中醫藥大學王海波教授鑒定為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖。

2 方法與結果 2.1 色譜條件 ODS-C18色譜柱(5μm，150×4.6mm)，柱溫30℃，流動相為乙腈0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min。

2.2 測定波長的確立經參考文獻，并經紫外—可見分光光度法測定，綜合三種對照品吸收情況，確定測定波長為290nm。

2.3 溶液制備對照品制備：精密稱取阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品適量，加甲醇溶解，制成每1mL各含0.1mg、0.2mg、0.1mg的對照品儲備液溶液備用，再按照試驗需要加甲醇稀釋至不同濃度。供試品溶液制備：土茯苓藥材粉碎，取粉末1.5g，精密稱定，加70%甲醇適量，加熱回流提取兩次，一次2h、一次1.5h。提取液合并，水浴濃縮至干，殘渣加甲醇適量溶解，定量轉移至5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 方法學考察 2.4.1線性范圍考察：取阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品溶液，分別精密吸取3、6、9、12、15μL溶液，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，以對照品濃度(mg/L )為橫坐標，繪制標準曲線。結果阿魏酸的回歸方程為y = 2087.2x + 1.77 (r=0.9993)；落新婦苷的回歸方程為y = 85.362x + 58.07(r= 0.9992)、白藜蘆醇的回歸方程為y = 113.57x + 17.49(r= 0.9995)。

2.4.2精密度實驗：取本品1.5g，精密稱定，制成供試品溶液，在4℃低溫保存。精密吸取同一供試品溶液20uL，按2.3項下方法操作，連續進樣5次，測定色譜峰面積，相對標準偏差(RSD)(n=5)分別為1.8% 、2.0% 、3.0% ，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗：取曬干桑葉供試品溶液分別于0，3，6，12h進樣，進樣體積20uL，記錄峰面積。阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量的RSD分別為2.1% 、2.5% 、2.3% ，表明樣品溶液在12h內基本穩定。

2.4.4重復性試驗：取土茯苓藥材樣品，分別稱取五份，每份1.5g，精密稱定，按 2.3項下供試品溶液的制備方法操作，制備樣品。分別精密吸取20uL，測定阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量，RSD(n=5)分別為1.0% 、2.5% 、2.9% ，表明本測定方法的重現性良好。

2.4.5回收率實驗：精密稱取已知準確含量的本品(阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量分別為0.06209mg/g、0.01609mg/g、0.02152mg/g)5份，各0.75g。分別置圓底燒瓶，精密加入阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品適量，按樣品制備方法操作。實驗結果提示：阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的回收率分別為101.5%、98.6%、99.60% ，RSD分別為2.9%、2.6%、3.5%。

表1 土茯苓藥材加樣回收率測定結果

2.5 樣品測定結果分別測定10批樣品中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量，含量范圍分別為0.03164～0.08176 mg/g、0.00682～0.02023mg/g、0.01624～0.02618mg/g，平均含量為0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。

3 討論本實驗較我國藥典新增了土茯苓阿魏酸和白藜蘆醇的含量檢測，細化了土茯苓的質量檢測標準。測定結果表明阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的線性范圍分別是0.02088～0.1044μg(r= 0.9993)、0.4284～2.142 μg(r=0.9992)、0.0432～0.216μg(r=0.9995)。方法穩定，重復性良好，結果準確，可作為土茯苓的質量控制方法。

本次研究中，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.025%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%磷酸水、以及乙腈-磷酸-三乙胺水溶液等不同組成、不同比例的流動相系統。發現乙腈-0.05%磷酸水溶液組成的流動相系統對樣品溶液中各種組分的分離最好，阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇三個測定成分與相鄰組分分離度最好。經篩選不同比例后確定18：82比例等度洗脫條件即可保證分離效果。

在供試品溶液制備方法考察中，進行了提取方法、提取溶劑的比較?；亓魈崛悠泛扛哂诔曁崛》?；提取溶劑考察中，70%甲醇提取效果優于甲醇溶劑。

在選定的色譜條件下，供試品溶液中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇與相鄰組分分離度良好，陰性液無干擾，經方法學考察，方法的重復性、穩定性、精密度、回收率試驗均符合有關規定。需要注意的是，在穩定性試驗過程中，樣品保存時間超過8h，白藜蘆醇成分的含量變化明顯，提示樣品液需要盡快進行測定。

[1] 陳紅梅，秀蘭，吳占全.土茯苓的化學與藥理研究進展[J].中國民族醫藥雜志，2008，14(11)：71-73.

[2] 仝玉柱.土茯苓治慢性胃炎[J].陜西中醫,2000，29(01)：40.

[3] 盧曉.土茯苓為主治療皮膚及血管疾病[J].陜西中醫,2001，22(12)：766.

[4] 李磊，張宏桂，孫毅坤，等.土茯苓藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中華中醫藥雜志，2007，22(4)：206．

[5] 李磊，張宏桂，喬延江，等.HPLC法測定土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇的含量[J].藥物分析雜志，2007，27(5)：654-656.

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[7] 蘇紅艷，劉玉強.高效液相色譜法測定土茯苓中薯蕷皂苷元的含量[J].遼寧中醫藥大學學報，2008,(5)：159.

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[9] 王清偉.萆薢、土茯苓、菝葜的臨床鑒別及應用[J].陜西中醫,2000，21(8)：378.

(收稿2014-09-01；修回2014-09-27)