茶多酚對缺血-再灌注大鼠p38信號通路及細胞凋亡的影響*

西安交通大學第二附屬醫院麻醉科(西安710004) 趙紅霞 高 瀅

茶多酚對缺血-再灌注大鼠p38信號通路及細胞凋亡的影響*

西安交通大學第二附屬醫院麻醉科(西安710004) 趙紅霞 高 瀅

目的：研究全腦缺血再灌注后茶多酚對p38信號轉導通路蛋白的表達及對大鼠海馬CA1區細胞凋亡的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法：126只雄性健康清潔SD大鼠隨機分為3組,缺血再灌注組(IR,n=42),假手術組(PO,n=42),茶多酚干預組(TP,n=42)。經典四血管阻塞法建立全腦缺血再灌注損傷模型, TP組給予腹腔注射茶多酚200 mg/kg,時間在全腦缺血再灌注結束之后，其余兩組則給予等劑量生理鹽水腹腔注入。各組均在再灌注后2、6、12、24、48、72h 處死大鼠,提取腦組織制備病理切片,免疫組化染色觀察磷酸化p38蛋白的表達；HE染色觀察海馬CA1區神經元形態結構的改變；TUNEL染色計算陽性細胞凋亡指數。結果：腦缺血再灌注損傷后凋亡細胞在海馬CA1區PO組少量表達,IR組顯著表達(P<0.05),TP組凋亡細胞表達在各時間點介于IR組和PO組之間(P<0.05)；與PO組比較,IR組在再灌注后各時點p38蛋白表達顯著增強(P<0.05),TP組較PO組表達增強但較IR組表達減弱(P<0.05)。結論：茶多酚可抑制大鼠全腦缺血/再灌注損傷時的p38蛋白活性,進而減少海馬椎體細胞凋亡,對腦缺血/再灌注損傷具有保護作用。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物細胞內重要的信號轉導系統，參與細胞的生長、發育、分化和凋亡等一系列病理生理過程[1]。MAPK家族主要包括ERK,p38MAPK和JNK通路3個主要成員。實驗結果顯示,活化的磷酸化p38蛋白參與了機體免疫與應激反應過程中的細胞凋亡。在細胞凋亡發生后及時干預可明顯減少由腦缺血后再灌注形成的繼發損傷所致的細胞凋亡的發生。茶多酚(Tea-polyphenols,TP)是由綠茶中提取的具有超強抗氧化劑作用的物質,具有較強的清除人體自由基、抗癌、抗輻射、穩定心血管系統功能等作用[2]。本研究探索在臨床麻醉手術中常見的腦缺血再灌注損傷后茶多酚對細胞凋亡的影響,為臨床研究腦保護及保護機制提供幫助。

材料與方法

1 材 料 雄性清潔級 Sprague-Dawley 大鼠126只,鼠齡55～65d,體重250±30g，實驗動物均在標準實驗條件下飼養1周,術前禁食12h。茶多酚(購自美國Sigma公司),原位末端標記細胞凋亡試劑盒(購自美國Promega公司),SABC免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒和p38磷酸化抗兔多克隆抗體(由北京博奧森生物科技有限公司提供)。

2 方 法 ①動物分組：126只Sprague-Dawley 大鼠隨機分為假手術組(PO組)，缺血/再灌注組(IR組)和茶多酚治療組(TP組)。各組均按再灌注時間點的不同分為2h、6h、12h、24h、48h和72h 6個亞組,每個亞組7只動物。②模型制作及取材：實驗動物采用經典4-VO法建立全腦缺血/再灌注損傷模型。手術第1日,IR組及TP組先用微電凝將雙側椎動脈凝斷,縫合傷口后放入籠中；第2日,分離第1日凝斷椎動脈大鼠的頸總動脈,然后用微動脈夾將雙側頸總動脈夾閉6min,頸總動脈夾閉后在實驗光源下觀察到大鼠瞳孔散大、嘴唇發紺、呼吸急促、眼球蒼白等變化。若在頸總動脈夾閉2min內瞳孔不散大者予以剔除,不計入實驗動物總數，然后重新納入新的實驗動物同前方法造模，歸入剔除的組內。PO組模型制作時僅暴露出實驗動物的頸總動脈及椎動脈,不凝斷椎動脈和夾閉頸總動脈。再灌注結束后TP組給予腹腔注射茶多酚200mg/kg,其余各組注射等量的生理鹽水。③HE染色及免疫組織化學SABC法染色：見參考文獻[3]。④TUNEL法檢測細胞凋亡：見參考文獻[4]。

3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HE染色 見圖1。PO組海馬CA1區約有3～4層椎體細胞,排列整齊,胞質淡紅,胞核藍染,核仁清晰。IR組鏡下可見神經元數目明顯減少,細胞漿呈嗜酸性變、細胞體深染、細胞膜及核膜皺縮、細胞核仁消失。而TP組大鼠海馬CA1區神經元數目較缺血再灌注組多，較假手術組為少，且細胞形態改變較輕，正常神經元與缺血損傷后神經元交錯分布。

2 磷酸化p38蛋白免疫組化結果 見圖2，表1。鏡下觀察切片,在腦缺血再灌注敏感區磷酸化p38蛋白的表達在各組不同，且與再灌注損傷時間相關。在PO組，表達不明顯，棕褐色陽性細胞較少，IR組棕褐色陽性磷酸化p38蛋白表達呈一定規律，即在再灌注結束后的2h開始微量表達,隨著再灌注時間的延長，其表達較之前更明顯，到再灌注后48～72h時，褐色陽性細胞數量最多，染色最明顯，當達到頂峰后開始出現下降,這一結果經統計學檢驗具有統計學意義(P<0.05)。而茶多酚干預后，TP組各時間點褐色陽性細胞表達較PO組多而較IR少(P<0.05)。

表1 茶多酚治療后各時點海馬CA1區磷酸化p38蛋白陽性細胞率比較 ±s)

注：與PO組相比，★P<0.05；與IR組相比，▲P<0.05

3 TUNEL法檢測細胞凋亡結果 見圖3,表2。檢測結果統計，凋亡細胞在各組分布不同，最多表達于IR組，且隨著再灌注時間的不同，凋亡細胞表達呈先升高至高峰后又開始下降，高峰時間在再灌注后48h，凋亡細胞表達最少在PO組，而TP組凋亡細胞的表達介于IR組和PO組之間。

表2 茶多酚治療后各時點海馬CA1區椎體細胞凋亡指數比較±s)

注：與PO組相比,★P<0.05；與IR組相比,▲P<0.05

討 論

眾所周知,腦缺血/再灌注損傷后細胞死亡主要有壞死和凋亡兩種形式,而壞死的發生較早,且呈瀑布式級聯反應,因此,對于研究著來講似乎無法干預，而凋亡的發生則較壞死發生滯后[5]。既往研究資料顯示，在腦缺血再灌注后2～4d都可以觀察到凋亡的發生,因此，針對凋亡的干預應該成為臨床研究的重點。本實驗結果顯示，大鼠全腦缺血2～4h后,p38活性開始增高,3～4d后達到峰值。同時,細胞凋亡檢測結果顯示：腦缺血/再灌注損傷后，凋亡細胞在6h開始增多，24～48h達到高峰,72h開始下降。二者的發生在時間上具有一致性，且p38蛋白含量的高低與細胞凋亡程度呈正相關。這一結果表明,p38MAPK通路在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用,即在細胞凋亡的早期即被激活而誘導和加重細胞凋亡的發生。

茶多酚是一種強效的天然抗氧化劑,具有降壓、降脂、抗氧化等臨床作用,在人群免疫及保健方面發揮重要作用,本實驗還發現,茶多酚在全腦缺血再灌注損傷后抑制細胞凋亡方面起重要作用，其抗細胞凋亡的機制可能主要與抑制細胞膜上的海人藻酸受體和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體所介導的Ca2+內流有關[6]。其次,茶多酚有強大的抗氧化作用,可以清除細胞內所產生的氧自由基[7]。

通過本實驗研究，得出以下結論：茶多酚可以通過多種作用機制改善腦缺血/再灌注后所致的細胞損傷，減輕細胞凋亡的發生，其中，最可能的機制則與抑制p38MAPK通路的活性相關，從而為臨床治療常見的休克，呼吸心跳驟停等提供新的思路。但基于目前的研究現狀，還無法達到這一目的，期待在今后的研究中有更佳的發現。

[1] 粟建新.茶多酚分對大鼠皮層神經元的保護作用研究[J].中國現代藥物應用，2014，8(1)：236-237.

[2] 李 軍，辛 勤，楊 雁.綠茶多酚藥理作用的研究進展[J].中國熱帶醫學，2014，14(1)：128-130.

[3] 王 智,薛榮亮,趙紅霞,等.姜黃素對缺血/再灌注損傷大鼠APE/Ref-1表達及細胞凋亡的影響[J].山東醫學雜志,2013,37：1-4.

[4] 王 智,薛榮亮,趙紅霞,等.依達拉奉對大鼠XRCC1和細胞凋亡的影響[J].實用醫藥雜志,2012,15(9)：537-540.

[5] 趙保路.茶多酚保護腦神經防止帕金森病損傷作用及其分子機理[J].生物化學與生物物理進展,2008, 35(7)：735-743.

[6] 劉軍權,陳復興,鞏新建,等.茶多酚增強T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的作用研究[J].陜西醫學雜志,2010,39(4)：355-357,367.

[7] 薜榮亮，紀 娜，高 靜，等.茶多酚對大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學雜志，2011，31(9)：1117-1119．

(收稿：2014-10-13)

*國家自然科學基金資助項目(30571790)

腦 再灌注損傷 細胞凋亡 p38有絲分裂原激活蛋白激酶 @茶多酚

R743.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.005