BVDV河南分離株人工感染家兔試驗

卜凡亮　宋明　河南省濟源市畜牧局動物衛生監督所　459000

BVDV河南分離株人工感染家兔試驗

卜凡亮宋明河南省濟源市畜牧局動物衛生監督所459000

為了了解牛病毒性腹瀉病毒河南分離株對家兔的致病性，采用腹腔注射方法感染家兔，通過體溫測定、臨床觀察1周后剖殺，采用RT-PCR技術對血清、脾臟、肝臟、淋巴結和腸黏膜進行檢測。結果顯示，家兔對牛病毒性腹瀉病毒河南分離株的感染不呈現明顯癥狀，牛病毒性腹瀉病毒分離株對家兔無明顯致病變影響。

1　材料與方法

（1）試驗地點、時間。本試驗于2013年3月24日至5月3日在河南農業大學寄生蟲學實驗室進行。

（2）試驗材料。從鄭州市某養殖場購入5只1月齡左右、體重約0.3kg的斷奶家兔，臨床各項指標正常，精神狀態良好，BVDV糞便PCR檢測陰性。分籠標記后喂以全價顆粒飼料，自由采食和飲水，隔離飼養1周，每天上、下午各測體溫1次，對健康者進行試驗觀察。毒株與細胞株為牛病毒性腹瀉病毒Oregon C24V株，購買于中國獸醫監察所，在本試驗中做標準對照株；BVDV-MQ01分離株為本次待測株，由寄生蟲學試驗室分離保存。胎牛腎細胞（MDBK）來源于北京協和細胞資源中心。主要試劑為M-MLV反轉錄酶、RNase抑制劑、Premix EX Taq DNA聚合酶、DMEM細胞培養基、新生馬血清、EDTA、胰蛋白酶，主要儀器為TGL-16B高速臺式離心機、PTC-200型PCR儀、DYY-Ⅲ-8B穩壓穩流型電泳儀、UV-2000紫外分析儀和紫外凝膠成像系統。

（3）試驗方法。迅速地從液氮中取出凍存含有MDBK細胞的凍存管，立即將凍存管放入42℃水浴中快速溶化，然后將含有細胞凍存懸液的凍存管移入離心管中，1000r/min離心5min，棄上清液。將細胞沉淀物移入含有6~8mL完全培養基（含馬血清10%）的培養瓶(25mL培養瓶)，置于CO2培養箱（5.0%CO2，37℃）培養24~48h，觀察細胞的生長情況。取長成單層MDBK細胞的培養瓶，棄去原培養液，接種OregonC24和BVDV-MQ01的病毒細胞培養液約1mL，吸附1h后棄去病毒液，加入6mL細胞維持液（含有馬血清2%~3%）培養，間隔24h觀察1次。對照組用不接種病毒的細胞。維持培養72～96h收毒，-70℃保存備用。

將病毒樣品作10倍系列稀釋，接種至已鋪滿MDBK細胞單層的96孔培養板中，每稀釋度接種8孔，37℃吸附1h后，按0.1mL/孔加入含2%馬血清的細胞維持液，放入37℃、5% CO2培養箱中培養。逐日觀察記錄細胞病變情況，96h后進行判斷，采用Reed-Muench法測定純化BVDV的毒價。TCID50的對數=高于50%病毒稀釋對數-相應距離比×稀釋系數的對數（10倍遞進稀釋時為1）。距離比例=1.3.3病毒的濃縮與純化，采用PEG濃縮法對所收獲的病毒液進行濃縮。取反復凍融3次各代次合并后的細胞毒，2000～3000rmp離心15min，取上清液。將上清液裝入處理好的透析袋內，用PEG-6000包埋透析袋，4℃作用數小時。待透析袋內的液體量濃縮至原來的1/5～1/10時將其吸出，-20℃保存備用。

分別用滅菌生理鹽水（含雙抗）將兩種純化病毒稀釋至10mL。對照組1只，編號1號，采取腹腔注射2mL含雙抗的滅菌生理鹽水；試驗組4只兔子，編號2~5號，編號為2號和3號的兔子采用腹腔注射分別注入BVDV標準毒株2mL，編號為4號和5號的兔子采取同樣的方法分別注入BVDV河南分離株2mL，接種后每天于下午4點測1次體溫，記錄數據。

接種后每天采集糞便，冷凍備用，于攻毒后7天剖殺，無菌采取脾臟和淋巴結置-70℃保存備用；心臟采血分離血清，置-20℃保存。將組織樣品無菌操作放入滅菌平皿中，用含雙抗的Hank’s液洗滌3次，剔除組織被膜上所附著的脂肪等結締組織，將組織樣品置乳缽中，剪碎。剪碎后的脾臟組織碎塊移入200mL燒杯中，按一定比例加入Hank’s液（含雙抗）后勻漿10000r/min離心2min，吸取組織勻漿液于250mL試劑瓶中，-20℃保存。反復凍融3次后，以2000r/min離心15min，吸取上清液，分裝入15mL試劑瓶內，-20℃保存。采取RT-PCR方法對所采取的病料進行檢測。

病料的RT-PCR檢測。(1)引物的設計合成。根據GenBank的公布的BVDV標準毒株Oregon C24V及其他株的5'-UTR保守區設計引物對F和R，該引物擴增出長度為285bp片段，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。(2)病毒RNA的提取。按照invitrizol公司Trizol說明書提取病料中RNA。(3)反轉錄cDNA的合成。以RNA為模板，用一擴下游引物F2與R2進行反轉錄制備cDNA，首先將RNA和下游引物F2、R2混合，70℃水浴10min，冰浴5min，然后加入其他成分。42℃水浴1h，70℃水浴15min。用20μL反應體系進行反轉錄。(4)PCR擴增cDNA。以cDNA為模板，分別用引物對F1-F2和R1-R2進行PCR擴增，反應按25μL體系進行。(5)瓊脂糖凝膠電泳檢測。取5μLPCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的片段的擴增結果。

2　結果與分析

2.1攻毒前BVDV毒價測定結果

(1)攻毒前采用Reed-Muench法測定純化。BVDV標準株與分離株BVDV-MQ01的TCID50分別為10~ 5.465與10~6.5TCID50/mL。

(2)攻毒后家兔臨床表現情況。攻毒后2天內家兔食欲略有減少，飲欲增加，活動減少，糞便無明顯變化，兩天后即恢復正常。

（3）攻毒后家兔體溫的變化。家兔攻毒后3天內體溫均有不同程度的升高，最高體溫升高到40.8℃，體溫上升幅度最小的也至40℃，且標準毒株組的體溫變化比分離組升高明顯。4天后試驗組家兔體溫均恢復正常，直至處死，體溫一直處于正常狀態。整個試驗過程中對照組家兔體溫正常。分別將實驗組4只兔子的體溫與對照組做統計分析（t檢驗），其P值都遠遠大于0.05，表明BVDV可以導致家兔短期內體溫出現升高，但是整體來說升高幅度并不顯著。

（4）實驗組家兔剖檢臟器病變情況。通過對攻毒1周后的試驗兔剖檢觀察，發現各臟器無明顯病變。

（5）RT-PCR結果。RT-PCR擴增結果Fig2 the resuIt of RT-PCR expands increase P陽性對照，血清、淋巴結、脾臟、糞便、腸黏膜，N陰性對照，5種病處理后經RT-PCR擴增，用BVDV OregonC24標準毒株作為陽性對照，經凝膠電泳后均得到一條大小為285bp的特異性條帶，擴增片段與預期片段相符。表明試驗采集的病料中均含有BVDV河南分離株病毒，人工感染成功。

3　結論與討論

（1）BVDV與CSFV接種家兔后的異同。BVDV 與CSFV同屬瘟病毒屬，血清學檢測已證明兩者在抗原上有相似性，二者間有較近的親緣關系。CSFV攻毒家兔可以產生定型熱，而本試驗結果表明，BVDV攻毒家兔后雖有體溫變化，但是未出現定型熱反應。鄧宇等用耳緣靜脈的方法將BVDV Oregon C24標準毒株感染3kg左右家兔，研究了BVDV對家兔致病性表現，結果顯示家兔攻毒后6h體溫有升高，6h后即恢復正常。本試驗中家兔0.3kg左右，腹腔注射接毒4天后體溫才恢復正常。這一結果表明，家兔對同一BVDV毒株反應的差異可能與所在發育階段、接種方式和不同的環境變化刺激（溫度、飼養環境）有關。

（2）BVDV對不同動物的感染結果。BVDV的主要感染宿主為牛、羊、豬、鹿。實驗條件下，大多數感染豬臨床上觀察不到明顯的癥狀，呈亞臨床感染；羊、兔均能產生不具有臨床表現的帶毒狀態。BVDV感染家兔后除了體溫變化并無特征性臨床癥狀和明顯剖檢病變。

（3）BVDV標準株和分離株人工感染家兔結果。BVDV的標準株和分離株人工感染家兔后，臨床表現和剖檢結果無明顯區別，但標準株比分離株引起體溫升高明顯，由接種前毒價的測定可知，是由于BVDV標準株毒價高于河南分離株。因為時間有限，本實驗沒有做病理切片進行觀察，是否會造成一定的病理變化，還有待于進一步試驗證實。

（4）RT-PCR在牛病毒性腹瀉病檢測中的應用。目前，研究人員建立了很多種方法用于BVDV的檢測，如病毒分離、電鏡觀察、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、瓊擴試驗、RT-PCR、實時熒光定量RTPCR方法等。本試驗通過對儀器設備及試驗目的綜合考慮，最終采用RT-PCR方法進行檢測。RTPCR技術經濟、快速、敏感、特異，可以在實驗研究和流行病學調查上大量推廣使用。