帶科絳蟲的膜聯(lián)蛋白研究進(jìn)展

衛(wèi)春曉 李天麗 索延樂 河南省濟(jì)源市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 459000

膜聯(lián)蛋白是一類依賴鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白家族。這類蛋白廣泛存在于多種生物，如哺乳動物、霉菌和植物等物種中，常常與質(zhì)膜或內(nèi)膜系統(tǒng)相結(jié)合，具有依賴于鈣離子的磷脂結(jié)合、抗凝合、抗炎癥等生物學(xué)活性。由于膜聯(lián)蛋白具備與鈣離子結(jié)合的能力，因此膜聯(lián)蛋白能夠參與一系列的依賴于鈣離子的膜性生物學(xué)活動。

1 膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

依照基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系以及在染色體上的定位不同，膜聯(lián)蛋白可以分為5 個(gè)大類:A 類脊椎動物膜聯(lián)蛋白、B 類無脊椎動物膜聯(lián)蛋白、C 類真菌和單細(xì)胞真核生物膜聯(lián)蛋白、D 類植物膜聯(lián)蛋白和E 類原生生物膜聯(lián)蛋白。所有的膜聯(lián)蛋白都具有一個(gè)高度保守的中心結(jié)構(gòu)域，可以通過鈣離子介導(dǎo)的方式與細(xì)胞磷脂可逆的結(jié)合膜聯(lián)蛋白中心結(jié)構(gòu)區(qū)域由重序列組成，每個(gè)重復(fù)含有5 個(gè)α-螺旋(A～E)組合成為圓盤結(jié)構(gòu)膜結(jié)合位點(diǎn)在AB 和DE 環(huán)凸起處，一般為Ⅱ型鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，其中G-X-G-T域位于AB 環(huán)。當(dāng)膜聯(lián)蛋白和磷脂膜結(jié)合時(shí)，凸面接近生物膜，凹面背向生物膜，背向生物膜的凹面能夠和游離的N 端相互作用。

2 膜聯(lián)蛋白的功能

動物膜聯(lián)蛋白具有高度特異的氨基端，與動物膜聯(lián)蛋白功能有關(guān)。不同的動物膜聯(lián)蛋白其氨基酸殘基組成的長度有很大不同。動物膜聯(lián)蛋白能夠參與生物膜的形成AnxA1 或A2 可以利用兩個(gè)分子的氨基端與一分子S100C 結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，從而促使膜聯(lián)蛋白所連接的生物膜進(jìn)行融合。AnxA2 還參與氯離子通道的形成，通過N 端和S100A10 蛋白結(jié)合，把離子通道元件轉(zhuǎn)運(yùn)并定位到細(xì)胞膜上。AnxA2 的輕鏈p11 可以和鈉離子通道的N 端直接結(jié)合，促進(jìn)納離子通道的膜結(jié)合，產(chǎn)生離子通道功能。

3 帶科絳蟲與膜聯(lián)蛋白

3.1 豬帶絳蟲與膜聯(lián)蛋白32 基因

孫樹漢等采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了豬囊尾蚴的cDNA 文庫，以囊蟲病患者、囊蟲病病豬的血清為探針，從cDNA 文庫中篩選囊蟲病診斷抗原及其編碼基因，獲得了人、豬共同抗原2 個(gè)(分子量分別為28kDa 和18kDa)，人特異性抗原和豬特異性抗原各1 個(gè)(分子量分別為34kDa 和14kDa)。cC1 基因全長為1070bp，含有747bp 的ORF，編碼249 個(gè)氨基酸的多肽，推導(dǎo)分子量為27.36kDa。由于cC1的cDNA 序列具有4 個(gè)膜聯(lián)蛋白家族典型的保守序列，故將cC1 歸屬為膜聯(lián)蛋白家族，命名為膜聯(lián)蛋白32(Annexins32)。

陳蕊雯等將cC1cDNA 片段以BamHⅠ和PstⅠ克隆到pGEM-32 載體，改換限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)成BamHⅠ和PstⅠ，加上人工接頭Pst-BamHⅠ-PstⅠ后，克隆到pGEX-5T，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-5T-cC1。結(jié)果表明，培養(yǎng)3小時(shí)，IPTG 誘導(dǎo)6小時(shí)，cC1表達(dá)量最高，表達(dá)量占47% 。Westernb1ot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬囊尾蚴抗原cC1 蛋白與囊尾蚴病豬血清有特異性結(jié)合條帶。

王慶敏等將膜聯(lián)蛋白32 在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫家兔，獲得抗膜聯(lián)蛋白32 的多克隆抗體。用多克隆抗體的免疫組化法對豬囊尾蚴抗原膜聯(lián)蛋白32 進(jìn)行組織定位，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白32 主要在囊尾蚴的囊壁中表達(dá)，頭節(jié)部表達(dá)較少，囊尾蚴周圍的肌肉中也有表達(dá)，即表明膜聯(lián)蛋白32 主要分布于囊尾蚴的囊壁，而且可能是一種分泌性蛋白，它可以分泌到周圍的肌肉組織。

3.2 豬帶絳蟲與膜聯(lián)蛋白B2 基因

王娜從豬帶絳蟲六鉤蚴中克隆出AnxB2 基因，證明AnxB2 在六鉤蚴階段表達(dá)。并對AnxB2基因分別進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)研究，均成功表達(dá)出了具有較高活性的重組蛋白質(zhì)。

3.3 亞洲帶絳蟲與膜聯(lián)蛋白B2 基因

戴佳琳等利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA 文庫中篩選出Annexins B2 基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3 中誘導(dǎo)表達(dá)，成功表達(dá)出高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲及牛帶絳蟲患者的血清識別。

3.4 亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白B3 基因

黃映康等利用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站及工具進(jìn)行序列分析、預(yù)測其編碼的膜聯(lián)蛋白B3 的理化特性等。結(jié)果該基因全長1176bp，編碼區(qū)為70～588bp，編碼173 個(gè)氨基酸，為全長基因;無跨膜區(qū);具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和B 細(xì)胞線性表位;蛋白的理化性質(zhì)穩(wěn)定，理論分子量為19339.7;沒有質(zhì)體、線粒體定位序列;氨基酸序列高度保守。

4 展望

迄今為止，大量的膜聯(lián)蛋白實(shí)驗(yàn)主要針對豬帶絳蟲囊尾蚴的研究，也有一些有關(guān)亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白的研究，但對與其他同科的絳蟲研究尚未見報(bào)道。現(xiàn)有研究表明，膜聯(lián)蛋白B3 是扁形動物門Annexins 家族新成員，因此對該基因的研究有助于進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能及開辟預(yù)防治療寄生蟲病的新途徑。絳蟲膜聯(lián)蛋白annexins B 家族中3 個(gè)膜聯(lián)蛋白分子均包含4 個(gè)序列和結(jié)構(gòu)高度相似的結(jié)構(gòu)域，其中annexin B2 所含有的motif 種類最多，具有人膜聯(lián)蛋白家族所有的motif。annexin B1和annexin B2 具有寄生生物所特有的氨基酸殘基和功能域。已發(fā)現(xiàn)的絳蟲膜聯(lián)蛋白家族都具有抑制血小板凝集的作用，其中annexin B2 活性最強(qiáng)，annexin B3 的作用最弱。因此，利用一些方法檢測該基因在其他絳蟲四個(gè)不同發(fā)育階段即頭節(jié)-幼節(jié)-成節(jié)-孕節(jié)中的表達(dá)差異，有助于更好地對絳蟲膜聯(lián)蛋白基因進(jìn)行研究，為絳蟲病的藥物及疫苗研究提供理論依據(jù)。