左、右歸丸通過TGF-β1/Smad4 信號途徑對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)的影響

何麗娟 宋 囡 何文智 孫月嬌 初 杰 任艷玲

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，在體內(nèi)是成骨細胞的主要來源〔1〕；在體外實驗中，BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細胞得到了肯定。已經(jīng)證明的誘導(dǎo)方法有很多〔2，3〕，但是有關(guān)中藥湯劑誘導(dǎo)BMSCs骨向分化的報道尚不多見。左歸丸的主要功效是填腎精、益骨髓，右歸丸的主要功效是補命火，壯腎陽。本課題組前期體外研究已經(jīng)表明左、右歸丸及其拆方含藥血清能協(xié)同誘導(dǎo)劑促進 BMSCs 成骨分化，左歸丸和滋腎陰藥的誘導(dǎo)作用優(yōu)于右歸丸和補腎陽藥〔4〕。但是其誘導(dǎo)機制尚不明確。本實驗通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步探討左、右歸丸對BMSCs的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD大鼠20只，體重220～240 g，雌雄不限。提取和培養(yǎng)采用同種2月齡雄性大鼠1只。均由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.2藥物及試劑 中藥飲片購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，左歸丸成分：熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、牛膝9 g、龜板膠12 g，右歸丸成分：熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、當(dāng)歸9 g、肉桂6 g、杜仲9 g、附子6 g。將兩種藥方制備成水煎劑，生藥量為1 g/ml。改良型 α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)(Hyclone)；胰酶(Sigma)；抗堿性磷酸酶(ALP)抗體(博奧森)；抗-GAPDH 抗體(中杉金橋)；抗-TGF-β1、抗-Smad4抗體(Santa Cruz Biotechnology)。免疫組化及DAB試劑盒(博士德)。

1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津，日本)，WD-9413B凝膠成像分析儀(北京六一)；DFC320型倒置顯微鏡(Leica，德國)；BX53型顯微鏡(Olympus，日本)。

1.4方法

1.4.1含藥血清制備與實驗分組 將大鼠隨機分為左歸丸組(ZGW)、右歸丸組(YGW)、補佳樂組(BJL)、空白對照組，雌雄各半，每組5只制備含藥血清。按每公斤體重大鼠的給藥量為成人的6.3倍計算，并且每次給大鼠灌胃量為正常人用藥量的2倍，分別為左歸丸組：19.1 g/kg體重、右歸丸組：20.72 g/kg體重、西藥組：0.38 mg/kg體重、空白對照組：1.0 g/kg體重，每日灌服2次，藥物生藥量為1 g/ml，空白對照組灌服蒸餾水。于第4天早晨給藥2 h后，腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，大鼠腹主動脈取血，靜置2 h后離心(2 500 r/min，4 ℃，20 min)并收集血清，56℃水浴滅活30 min，分裝，-86 ℃保存。實驗分為5組，其中Control組含10%空白對照組血清的α-MEM培養(yǎng)液，ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組和BJL+YDJ組含有相對應(yīng)的10%藥物血清及誘導(dǎo)劑(YDJ，含10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μmol/L維生素C的α-MEM培養(yǎng)液)，YDJ組含10%YDJ。

1.4.2BMSCs分離培養(yǎng) 將2月齡的SD大鼠脫頸處死，然后用75%酒精浸泡15 min，移入超凈臺后在無菌狀態(tài)下取雙側(cè)股骨和脛骨，剪下骨的兩端，使骨髓腔充分暴露，用含青、鏈霉素的 α-MEM 培養(yǎng)液5 ml反復(fù)沖洗骨髓腔至骨的顏色變白為止，然后把平皿中的液體移入離心管中，離心(1 000 r/min，3 min)并棄去上清液，用含10% FBS的 α-MEM 培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細胞重懸后轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞傳代至第4代，即可用于實驗。

1.4.3ALP的蛋白檢測 采用 Western印跡法。P4代BMSCs 細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，4 d后饑餓24 h(饑餓培養(yǎng)液為含0.2% FBS的 α-MEM 培養(yǎng)液)，加入各組培養(yǎng)液6 ml繼續(xù)培養(yǎng)9 d，然后倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，甩干，每瓶細胞加入PBS 1 ml，細胞刮至瓶底一角，收集至預(yù)冷的EP管中，12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清，每瓶細胞加入裂解液80 μl并反復(fù)吹打10次左右，冰上靜置30 min，再次離心12 000 r/min、4℃，取上清至EP管中；BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣品20 μl，電泳，轉(zhuǎn)膜3 h，一抗37℃水浴孵育1 h后，4℃過夜，次日二抗37℃水浴孵育1 h，然后暗室中加入 ECL發(fā)光液，X光膠片曝光30 min，掃描圖像并且分析結(jié)果，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值作比較，得出比值后再各組比較。

1.4.4TGF-β1及Smad4免疫組化染色(SP法) P4代BMSCs細胞接種于12孔板中，12孔板中每一孔預(yù)先鋪好一次性塑料細胞培養(yǎng)片，約5 h后(細胞已貼壁) 加入各組培養(yǎng)液1 ml繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，從12孔板中取出細胞爬片經(jīng)PBS 液清洗1次，多聚甲醛固定15 min，PBS液清洗2～3次。用0.5% Triton X-100做破膜處理，再用PBS洗2～3次，每次3 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫作用20 min封閉非特異性結(jié)合點。甩去多余液體，滴加1∶50稀釋的兔抗大鼠TGF-β1抗體(1抗)和1∶50稀釋的小鼠抗大鼠 Smad4 抗體(1抗)，放入濕盒內(nèi)4℃過夜。PBS液洗2～3次，每次3 min，滴加辣根酶標(biāo)記二抗，TGF-β1為抗兔，Smad4為抗小鼠，比例均為1∶500，室溫靜置1 h，PBS液洗5 min共3次。DAB顯色5～10 min (顯微鏡下掌握顯色程度)，PBS液或自來水沖洗10 min，蘇木精輕度復(fù)染2 min，自來水沖洗10～15 min，脫水、透明、樹脂二甲苯封片，鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 細胞接種于培養(yǎng)瓶24 h后可見少量細胞貼壁，以圓形居多，透亮；4 d后可見貼壁的細胞已有大部分，并且形成突觸，細胞呈現(xiàn)多角形或菱形時進行第一次換液；10～12 d后，細胞融合率達到80%，首次傳代，細胞傳到P4 代時大多呈紡錘形，旋渦狀排列(圖1)。

2.2左、右歸丸對BMSCs的ALP蛋白表達的影響 與Control相比，ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組、BJL+YDJ組、YDJ組都可以使 BMSCs中的ALP蛋白表達增強 (P<0.01)；與YDJ組相比，ZGW+YDJ組和YGW+YDJ組均可增強BMSCs中ALP蛋白的表達(P<0.01)，BJL+YDJ組對BMSCs中ALP蛋白的表達無明顯促進作用，而與YGW+YDJ組比較，ZGW+YDJ組對BMSCs的ALP蛋白的表達也無明顯促進作用(P<0.01)。見圖2。

圖1 BMSCs細胞形態(tài)

A～E:對照組，ZGW+YDJ組，YGW+YDJ組，BJL+YDJ組，YDJ組;與對照組比較：1)P<0.01;與YDJ組比較：2)P<0.01,gn YGW+YDJ組比較：3)P<0.01；下圖同

2.3左、右歸丸對BMSCs中TGF-β1蛋白表達的影響 大鼠BMSCs中TGF-β1的陽性表達位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色。與Control組相比，ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組、BJL+YDJ組、YDJ組都可以增強BMSCs中TGF-β1蛋白表達(P<0.01)；與YDJ組相比，ZGW+YDJ組和YGW+YDJ組均可顯著促進BMSCs中的TGF-β1的表達，但是BJL+YDJ組對BMSCs中TGF-β1的表達無明顯促進作用(P<0.01)，而與YGW+YDJ 組比較，ZGW+YDL組對BMSCs中的蛋白的TGF-β1表達也無明顯促進作用(P>0.05)。見圖3。

2.4左、右歸丸對BMSCs中Smad4表達的影響 大鼠BMSCs 中Smad4的陽性表達位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色。與Control組相比，ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組、BJL+YDJ組、YDJ組都可以增強BMSCs中Smad4蛋白表達(P<0.01)；與YDJ組相比，ZGW+YDJ組和YGW+YDJ組均可顯著促進BMSCs中Smad4表達(P<0.01)，但是BJL組對BMSCs中Smad4的表達無明顯促進作用，而與YGW+YDJ組比較，ZGW+YDJ組對BMSCs中Smad4表達有明顯促進作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 TGF-β1及Smad4蛋白在BMSCs中的表達(免疫組化，×200)

3 討 論

BMSCs具有較強的分化和增殖能力，可分化多種胚層細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞等。沈自尹院士指出，干細胞具有先天之精的屬性，腎所藏之精可相應(yīng)于胚胎干細胞以及其他分化為各種組織器官的成體干細胞，故BMSCs與中醫(yī)之腎精相應(yīng)〔5〕。左歸丸和右歸丸均是填補精髓、陰陽互濟的代表方劑，可以促進成骨細胞中 Cbfα1、Col-Ⅰ、TGF-β1、Smad4 等蛋白的表達，可能通過調(diào)節(jié)骨重建和骨吸收治療骨質(zhì)疏松〔6〕。

ALP是成骨細胞的功能性酶，可以破壞細胞內(nèi)的鈣化抑制劑，從而啟動鈣化，是成熟的成骨細胞的早期標(biāo)志〔7～9〕。本實驗說明BMSCs可能通過左、右歸丸協(xié)同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)為成骨細胞。

TGF-β1是其中一種，是TGF-β各類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中必需的介質(zhì)。很多研究顯示TGF-β1在成骨細胞分化和骨重建中有重要作用〔10，11〕。Smad4 是 Smads 家族中的通用型蛋白，在TGF-β各類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，通過與活化的受體激活型 Smads 蛋白分子結(jié)合形成異源三聚體，完成信號由細胞膜到細胞核的應(yīng)答〔12〕。楊曉〔13〕研究發(fā)現(xiàn)Smad4基因敲除導(dǎo)致成骨細胞對BMP-2和TGF-β1的反應(yīng)性顯著降低。本次實驗研究表明，左歸丸可協(xié)同誘導(dǎo)劑明顯上調(diào)TGF-β1蛋白表達，促進Smad4蛋白的表達，而其他處理因素組相對促進作用不甚明顯。本研究結(jié)果表明，左歸丸和右歸丸可能是通過TGF-β1/ Smad4信號表達途徑影響B(tài)MSCs成骨，其具體作用機制，以及是否有MAPK信號通路中ERK1/2、p38和JNK三大信號旁路的參與，有待進一步研究。

4 參考文獻

1范 鍥，趙勁民，蘇 偉，等.地塞米松對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011;15(14)：2477-81.

2胡資兵，曾 榮，郭偉韜，等.骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化特征〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011;12(43)：8561-6.

3王 瑒，吳 文，李 正，等.骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的定向誘導(dǎo)分化〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2011;32(3)：401-3.

4宋 囡，王智民，任艷玲，等.左、右歸丸及其拆方對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2013;29(7)：1268-74.

5鄭洪新，王擁軍，李 佳，等.“腎藏精”與干細胞及其微環(huán)境及NEI網(wǎng)絡(luò)動態(tài)平衡關(guān)系〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2012;27(9)：2267-70.

6蒿長英，任艷玲，趙金茹.左歸丸含藥血清通過ERK / Smads號通路干預(yù)MC3T3-E1細胞的功能基因表達〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2012;28(6)：872-6.

7婁 鳴，李 曉，饒國洲.BMP-2，BGP mRNA 表達量及ALP活性的變化對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)成骨細胞的影響〔J〕.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008;23(5)：28-31.

8李 正，王 瑒，蘭愛平，等.TGF-β1在雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(12)：2357-61.

9杜俊杰，羅卓荊，胡蘊玉，等.TGF-β增強rhBMP-2誘導(dǎo)成骨中Ⅰ，Ⅱ型膠原及堿性磷酸酶的表達〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002;24(22)：92-5.

10Selvamurugan N，Kwok S，Alliston T，etal.Transforminggrowthfactor-1regulation of collagenase-3 expression in osteoblastic cells by across-talk between smad and MAPKsignaling pathways and their components，smad2 and runx2〔J〕.Biol Chem，2004；279(18)：19327-34.

11Maeda S，Hayashi M，Komiya S，etal.Endogenous TGF-signaling suppresses maturation of osteoblastic mesenchymal cells〔J〕.EMBO J，2004;23(3)：552-63.

12任艷玲，鄭洪新，杜 松.補腎健脾藥物血清對大鼠成骨細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad4表達的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2005;25(3)：289-91.

13楊 曉.Smad4 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β 信號調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持的功能〔J〕.生命科學(xué)，2008;20(2)：165-70.