松樹皮原花青素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用*

張文艷， 孫寶飛， 余資江**， 余 彥， 肖朝倫， 王玉林， 羅時鵬， 令狐艷

(1.貴陽醫學院 基礎醫學院 人體解剖學教研室， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫學院附院 呼吸內科， 貴州 貴陽 550004)

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松樹皮原花青素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用*

張文艷1，2， 孫寶飛1， 余資江1**， 余 彥1， 肖朝倫1， 王玉林1， 羅時鵬1， 令狐艷1

(1.貴陽醫學院 基礎醫學院 人體解剖學教研室， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫學院附院 呼吸內科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討松樹皮提取物原花青素對缺血再灌注小鼠腦損傷海馬神經元的保護作用。方法： 120只雄性昆明小鼠隨機分成正常對照組、假手術組、14 d模型組、28 d模型組、14 d治療組、28 d治療組，采取小鼠雙側頸總動脈結扎缺血15 min，再灌注15 min構建腦缺血再灌注損傷模型，治療組給予松樹皮提取物原花青素灌胃治療， Morris水迷宮實驗觀察小鼠學習記憶能力的變化，造模后第14、28天處死小鼠，HE染色法觀察小鼠腦組織病理形態學改變，透射電子顯微鏡觀察海馬神經元超微結構的改變。結果： Morris水迷宮結果顯示模型組小鼠學習記憶能力降低，與模型組相比，治療組小鼠學習記憶能力有所提升；14 d模型組腦細胞數量較假手術組明顯減少，胞漿著色淺，胞核移位，治療組尼氏體排列欠規律，部分細胞形態不規則，胞漿著色相對較淺，但比模型組好；電鏡下，小鼠海馬CA3區神經元在14 d模型組損傷嚴重，神經元胞體水腫、出現核固縮溶解現象，存在細胞器溶解后形成的空泡，線粒體嵴可見有斷裂，細胞出現凋亡小體， 28 d模型組有所恢復，14 d和28 d治療組神經元較同期模型組輕。結論： 松樹皮提取物原花青素對腦缺血再灌注損傷小鼠具有保護作用。

松樹皮提取物；原花青素；再灌注損傷；海馬；顯微鏡檢查，電子，掃描；細胞保護

腦缺血再灌注后引起的不可逆性的腦功能損害是臨床治療的難點。腦損傷后，神經細胞的死亡可分為2種，一種是直接損傷引起的細胞死亡，第二種是繼發性損傷引起的遲發性細胞死亡，目前對直接損傷引起的細胞死亡還無法避免，而對繼發性神經細胞損傷的保護作用是當今腦保護治療的關鍵[1]。松樹皮提取物中含有原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)，具有極強的抗氧化活性，是一種很好的自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑[2-3]。本研究以腦缺血再灌注小鼠為研究對象，觀察松樹皮提取物OPCs對腦缺血再灌注損傷小鼠學習和記憶能力的影響，同時觀察小鼠海馬超微結構變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年昆明種雄性小白鼠120只， 體重20～22 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK[(黔)2002-0001]，按隨機分組原則，將120只小鼠分為正常對照組、假手術組、14 d模型組、28 d模型組、14 d治療組和28 d治療組，每組各20只。室溫為(20±2)℃，濕度48%～60%。

1.2 實驗試劑及儀器

松樹皮提取物(西安賽奧生物技術有限公司)，Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)，透射電子顯微鏡(FEI公司TECNAI10)。

1.3 腦缺血動物模型建立

小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規消毒，自下頜骨到胸骨柄間作5～8 mm長的頸部正中切口，游離雙側頸總動脈及伴行神經，微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血15 min，然后松開微動脈夾，恢復血液灌注15 min，如此反復3次造成小鼠腦缺血再灌注損傷。以觀察到小鼠出現驚厥、呼吸深慢、心跳加快為腦缺血模型成功的標志。假手術組除不夾閉頸總動脈外，其余操作同模型組。治療組在處死前7 d給予松樹皮提取物OPCs(100 mg/kg)灌胃治療，每日1次。正常對照組、假手術組、模型組用等量生理鹽水灌胃。

1.4 學習記憶能力測試

Morris水迷宮實驗水池，平臺距液面1 cm。將水池分為NE、SE、SW、NW四個象限，水溫為25 ℃。定位航行實驗檢測小鼠學習能力：每次將小鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳60 s 使其熟悉迷宮環境，實驗共歷時5 d，每天訓練4次(固定時間段)；將平臺固定放置于NW象限中間，從池壁四個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池。記錄小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，4次訓練均將小鼠分別從4個不同的起始點(不同象限)放入水中；小鼠找到平臺后，在平臺上休息30 s再進行下一次試驗；60 s內找不到平臺的小鼠，則由實驗者將其引導至平臺，同樣休息30 s后再進行下一次試驗，潛伏期記為60 s；統計第5天小鼠4次訓練潛伏期的平均值作為其學習成績。空間探索實驗檢測小鼠記憶能力：定位航行試驗結束后將撤除平臺，將所有小鼠于同一點(任選某一象限中點)面對池壁放入水中，記錄 60 s內小鼠穿越原平臺所在象限時間作為評估指標[4]。

1.5 取材

腦缺血再灌注后第14、28天每組分別處死10只小鼠。每組取8只小鼠在相應時間點麻醉、處死、灌注固定，用于HE染色；腦缺血再灌注后第14、28天每組取出2只小鼠缺血側大腦海馬組織，切成約1 mm3小塊，行透射電鏡觀察并攝片。

1.6 HE染色

各組腦組織在左側大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm之間冠狀切取約5 mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成蠟塊，連續切片，厚5 μm，常規行HE染色，觀察病理形態學改變。

1.7 海馬神經元超微結構的觀察

每組取出海馬組織塊放入2.5%戊二醛固定24 h，1%鋨酸后固定2 h，丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片，鈾染，鉛染，利用FEI-TECNAI10透射電子顯微鏡觀察并攝片，以觀察海馬超微結構變化。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠腦組織病理變化

海馬區腦組織病理學染色(200倍光學顯微鏡下)顯示：假手術組排列整齊，可見有淺染的突起(圖1A)；與假手術組比較，14 d模型組細胞數量明顯減少，排列稀疏，胞體形態不規則，部分細胞壞死，胞漿著色淺，胞核移位(圖1B)。OPCs治療組尼氏體排列不規律，部分細胞形態不規則，胞漿著色相對較淺，但比模型組好(圖1C)。

A為假手術組，B為14 d模型組，C為14 d治療組

2.2 學習記憶能力

在定位航行實驗中，假手術組與正常對照組結果無差異(P>0.05)，14 d、28 d模型組小鼠逃避潛伏期明顯高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)，同時28 d模型組小鼠成績優于14 d小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；第14、28 d治療組小鼠需要更少的時間來找到隱藏于水面之下的站臺，成績優于同期模型組(P<0.05)?？臻g探索實驗中，假手術組與正常對照組結果無差異(P>0.05)，與假手術組相比，14 d和28 d模型組小鼠穿越原平臺所在象限時間明顯降低(P<0.05)，表明其記憶能力明顯降低，其中14 d模型組降低更明顯；與同期模型組相比治療組記憶能力有所好轉，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 小鼠海馬CA3區神經元超微結構

電鏡下，假手術組及正常對照組小鼠海馬CA3區神經元胞核形態規則，核膜光滑、完整，染色質分布均勻；胞漿細胞器豐富，粗面內質網分布規則，表面附有較多的核糖體顆粒，線粒體發達，其表面雙層膜和內部嵴清晰；細胞核及細胞器形態規則(圖2A-B)。14 d模型組海馬CA3區損傷嚴重，神經元胞體水腫，出現核固縮溶解現象，電子密度增高，胞漿中存在細胞器溶解后形成的空泡，殘存線粒體膜破壞嚴重，線粒體嵴可見有斷裂 (圖2C)。28 d模型組海馬CA3區較14 d組比較有所恢復，神經元胞體水腫減輕，電子密度增高，核膜邊界不清，間隙較大，染色質電子致密度增高，細胞器較假手術組減少，線粒體腫脹，可見嵴斷裂，少量線粒體嵴消失，粗面內質網囊狀擴張(圖2E)。14 d治療組海馬CA3區神經元較模型組受損減輕，胞體水腫現象減輕，細胞膜邊界欠清晰，細胞器數量增多，部分線粒體輕度腫脹，雙層膜結構不清，粗面內質網囊狀擴張(圖2D)；28 d治療組小鼠海馬CA3區同假手術組相比有一定差異，神經元細胞核形態較規則，電子密度相對較高，胞漿內線粒體數量減少，偶見少量線粒體輕度腫脹(圖2F)，與28 d模型組比較細胞損傷有不同程度的減輕。

表1 小鼠Morris水迷宮實驗結果比較Tab.1 Comparison of result of Morris water maze test

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與14 d模型組比較，P<0.05；(3)與28 d模型組比較，P<0.05

A為正常對照組；B為假手術組；C為14 d模型組；D為14 d治療組；E為28 d模型組；F為28 d治療組

3 討論

腦組織缺血將會導致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血時間長短及殘存血流量多少有關，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長時間的完全缺血或嚴重缺血會引起梗死。缺血后的血流恢復在某些情況下能導致進一步的組織損傷和功能障礙，恢復血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷，抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關鍵環節[5]。大量的研究表明，OPCs為有效的抗氧化劑，且無毒，無致突變性，無致癌性，無副作用[6]。

本研究采用了經典生理實驗Morris水迷宮來研究腦缺血再灌注后小鼠學習記憶能力的變化，發現小鼠缺血再灌注后學習記憶能力下降，在14 d損傷較重，28 d后相對減輕，可能與小鼠的自身修復有關，同既往研究結果相一致[7]。本實驗在給予原花青素治療7天后各組小鼠學習和記憶能力有顯著提升，說明原花青素對缺血再灌注小鼠學習記憶能力有明顯改善作用，王珠等[8]研究也發現葡萄籽原花青素能改善腦缺血再灌注大鼠的學習記憶功能。

本研究通過透射電鏡觀察到腦缺血再灌注損傷后小鼠海馬部位神經元細胞核及胞漿內細胞器發生了一系列病理改變。其中線粒體是細胞生物氧化的主要場所，當線粒體受到損傷后可能引起細胞內供能發生障礙，其結果將導致細胞凋亡或壞死，組織功能減退，其作用機制可能與缺血再灌注的直接作用、氧化應激、誘導凋亡等因素有關[9]。本實驗14 d模型組線粒體嵴破壞嚴重，細胞出現凋亡小體，14 d治療組較模型組超微結構有所好轉。近期研究表明原花青素能夠改善神經細胞的超微結構，進而保護低氧大鼠避免進一步腦損傷[10]。原花青素改善神經細胞可能是抑制缺血再灌注損傷中核轉錄因子-кB的表達，阻斷核轉錄因子-кB誘導的細胞因子表達的反應鏈，從而抑制細胞凋亡最終起到保護作用[11]。

此外，原花青素作為一種高效的抗氧化劑和自由基清除劑，能夠提高超氧化物歧化酶的活性，促進一氧化氮的產生，并降低血清內皮素的水平，從而發揮抗缺血再灌注損傷的作用；通過對炎癥因子表達的抑制，從而減輕腦缺血再灌注損傷[12]。因此，原花青素可能通過多種途徑保護腦缺血再灌注損傷腦組織，其具體機制有待進一步研究。

[1] 翟婷婷,蔡紅艷,云愛華.原花青素對腦缺血再灌注損傷羥自由基含量和腫瘤壞死因子-α表達的影響[J].中國實用醫藥, 2014(22):256-257.

[2] 于立梅,趙謀明,李瑩.基于響應面法的馬尾松樹皮原花青素提取及抗氧化性研究[J].食品與機械, 2007(1):64-68．

[3] 黃澈,閔鶴鳴,閔連秋,等.原花青素對腦缺血再灌注后大鼠海馬內質應激相關分子GRP78和CHOP表達的影響[J].中國新藥雜志, 2011(2):156-161.

[4] Peng Y. Hyperbaric oxygen preconditioning ameliorates anxiety-like behavior and cognitive impairments via upregulation of thioredoxin reductases in stressed rats[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010(6):1018-1025.

[5] 李建玲,何斌,李琳琳. 原花青素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 中國生化藥物雜志, 2011(6):463-466.

[6] 段國平,劉曉利,趙丕文.葡萄籽原花青素的藥理學研究進展[J].環球中醫藥, 2014(4):313-316.

[7] 肖朝倫,余資江,李玉美,等. 褪黑素對小鼠缺血再灌注腦損傷后海馬CA3 區神經元的保護作用[J],實用醫學雜志, 2011(23):4194-4196.

[8] 王珠,趙雅寧,李建民.葡萄籽原花青素對腦缺血再灌注大鼠氧化應激與學習記憶的影響[J],中國康復理論與實踐, 2014(9): 827-830.

[9] Polster BN, Fiskum G. Mintochondrial mechanisms of neural cell apoptosis[J]. Neurochem, 2004(6):1281-1289.

[10]趙雅寧,曹書華,郭霞,等.葡萄籽原花青素對慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應及學習記憶能力的影響[J]. 2014(491):29 -32.

[11]劉瑩,張花治,白麗君,等.原花青素對視網膜缺血再灌注損傷大鼠視網膜結構及轉錄因子-κB 表達的影響[J],中國中醫藥信息雜志, 2013(5):32-34.

[12]陳榮志,陸景紅,任明山,等.葡萄籽原花青素對大鼠腦缺血再灌注后NF-κB 、I-κB及iNOS的影響[J].華西藥學雜志, 2007(3):266-268.

(2015-01-29收稿，2015-03-08修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

Protective Effects of Pine Bark Extract on Brain after Cerebral Ischemia-reperfusion in Mice

ZHANG Wenyan1,2, SUN Baofei1, YU Zijiang1, YU Yan1, XIAO Chaolun1, WANG Yulin1, LUO Shipeng1, LINGHU yan1

(1.DepartmentofAnatomy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofRespiratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To explore the protective effect of procyanidin extracted from pine bark on hippocampus neurons of mice subjected to ischemia reperfusion brain injury. Methods: A total of 120 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups, namely normal control group, sham operation group, 14-day model group, 28-day model group, 14-day treatment group and 28-day treatment group. The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was constructed by bilateral carotid ligation ischemia for 15 minutes, and ischemia reperfusion for another 15 minutes. The treatment group was continuously given procyanidins by intragastric administration for 7 days before execution, and other groups were given the same amount of normal saline by intragastric administration. The change of memory capacity was observed in Morris water maze test. When mice were killed 14 and 28 days after model construction, the pathological changes of mice brain tissue were observed by HE staining method and the hippocampus ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Results: The result of Morris water maze test showed that compared with model group, learning and memorizing ability in treatment group was improved to some extent. Compared with sham operation group, cells number in 14-day model group was significantly decreased, cytoplasmic staining was light and cell nucleus was tanslocated. In treatment group the tigroid body was arranged irregularly, some cells was in irregular shape and cytoplasmic staining was relatively light. However, the situation in treatment group was better than that in model group. In 14-day model group, hippocampus CA3 neurons of mice were seriously damaged, pericaryon was in edema, karyopyknosis dissolving phenomenon occurred, organelles dissolved and formed vacuole, the mitochondrial cristae fracture was broken, and the apoptotic bodies occurred in cells. In 28-day model group, some recovery could be found. In 14-day treatment group and 28-day treatment group, the above-mentioned situation in neuron improved compared with same period of other model group. Conclusion: The procyanidins extracted from pine bark has the function of protecting mice subjected to cerebral ischemia reperfusion injury.

pine bark extract; proanthocyanidins; reperfusion injury; hippocampus; microscopy, electron, scanning; cytoprotection

貴州省科技廳社會發展攻關黔科合SY字(2012)3144號

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1236.009.html

R743.9; R961

A

1000-2707(2015)05-0450-05

**通信作者 E-mail:yzj0112@126.com