R-spondin1在促進人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用*

孫 博， 張 弢， 楊 龍， 李 靖， 任厚相， 孫 琦， 王建吉， 葉 川*

(1．貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫院 骨科， 浙江 杭州 311201)

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R-spondin1在促進人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用*

孫 博1**， 張 弢2， 楊 龍1， 李 靖1， 任厚相1， 孫 琦1， 王建吉1， 葉 川1***

(1．貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫院 骨科， 浙江 杭州 311201)

目的： 研究Wnt信號通路激活劑R-spondin1在人骨髓間充質干細胞(hBMSC)成骨分化中的作用。方法： 用0、5、10、20 μg/L R-spondin1處理hBMSC，利用熒光素酶實驗檢測R-spondin1對hBMSC中Wnt信號通路的作用，Western blot檢測R-spondin1對Wnt信號通路下游靶基因β-catenin蛋白表達的影響；在成骨分化培養基中添加20 μg/L R-spondin1誘導hBMSC成骨分化，檢測R-spondin1對早期成骨分化指標ALP活性及成骨分化晚期鈣沉積、成骨分化標志物OSX 、OCN和成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2表達的影響。結果： R-spondin1增強hBMSC中Wnt信號通路，R-spondin1增強ALP活性和鈣沉積，促進OSX、OCN及RUNX2的表達。結論： R-spondin1增強hBMSC中Wnt信號通路的作用，促進hBMSC成骨分化。

R-spondin1；Wnt信號通路；人骨髓間充質干細胞；成骨分化；RUNX2

骨缺損是臨床上常見的骨骼系統疾病，嚴重危害患者的生活質量。人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC)是成骨細胞的前體細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，在體外可定向分化為骨細胞，是骨再生工程理想的種子細胞，具有重要的臨床應用前景[1]。R-spondins是一個在多種生物中廣泛表達的分泌蛋白家族，人類RSPO家族包括四個家族成員，即R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3和R-spondin4[2]。研究發現，R-spondins主要是通過激活Wnt信號通路發揮其生物學功能[3]。由于Wnt信號在骨發生中發揮著重要作用，經典Wnt信號通路的激活能夠促進BMSC成骨分化，抑制成脂分化[4]。因此推測R-spondins在體外能夠通過調控Wnt信號通路促進人BMSC成骨分化。為了驗證這一推測，本研究選取了R-spondins家族成員R-spondin1，檢測了其對人BMSC Wnt信號通路和成骨分化的作用。

1 材料方法

1.1 材料

TOPflash質粒和pRL-SV40質粒由本實驗室保存，Lipofectamine 2000轉染試劑和RNA提取試劑TRIzol為Invitrogen公司產品，雙熒光素酶活性檢測試劑盒和反轉錄試劑盒購自Promega公司，SYBR Premix ExTaq M定量PCR試劑為大連寶生物公司產品，β-catenin、RUNX2、OSX和OCN抗體購自CST公司，Tubulin抗體購自Santa Cruz公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，茜素紅S(Alizrin Red S)為Sigma公司產品，α-MEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品。

1.2 BMSC的分離、培養和成骨誘導

經倫理委員會批準和本人簽署知情同意書，hBMSC取自一位32歲健康男性志愿者，采用密度梯度離心法獲取hBMSC，并在加有雙抗的含10%胎牛血清的α-MEM培養基中培養。實驗使用第4代hBMSC。將hBMSC接種至孔板中，待細胞密度約60%時加入成骨誘導分化液(10%胎牛血清的α-MEM培養基中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 mg/L維生素C和0.1 μmol/L地塞米松)，每3 d換液一次。使用0、5、10、20 μg/L R-spondin1處理細胞，觀察其對Wnt信號通路的作用是否具有劑量依賴效應。其余實驗所用的R-spondin1濃度均為20 μg/L。

1.3 熒光素酶活性檢測

將hBMSC接種至12孔培養板中，細胞密度長至70%左右時使用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染TOPflash質粒和pRL-SV40質粒，轉染24 h后使用20 μg/L的R-spondin1處理細胞24 h，收集細胞后按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶活性，每組樣品含有3個重復，相對熒光素酶活性為螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4 Western blot 分析

收集細胞，提取蛋白，蛋白定量后加入5×SDS沸水浴5 min，SDS-PAGE 電泳、轉膜，使用5%的脫脂奶粉封閉，1 h后加入相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次后加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，孵育2 h后用TBST 洗膜3 次，加入ECL發光劑顯色3 min后壓片顯影。

1.5 ALP活性檢測

BMSC成骨分化4 d，吸除培養板中的培養液，PBS洗2遍后，按試劑盒說明書進行ALP活性檢測，用酶標儀測出各孔吸光度值，同時采用BCA法檢測細胞內總的蛋白量，用以校正 ALP 活性。重復3次。

1.6 鈣鹽沉積實驗

hBMSC成骨分化14 d，棄去培養基后使用PBS洗2遍，戊二醛固定，使用ddH20清洗3次后加入0.4%茜素紅S，光鏡下觀察監測，待出現紅色物質堆積時棄去染液，使用ddH20終止反應和洗滌，顯微鏡下拍照。為了定量檢測鈣鹽沉積，染色后加入冰乙酸在搖床上孵育30 min，刮下后于85 ℃水浴10 min，冰上5 min，高速離心后15 min，取400 加入10%NH4OH，將pH調到4.5后，用酶標儀于405 nm處測吸光度值。

1.7 Real-time PCR

按TRIzol試劑盒說明書提取細胞RNA，反轉錄后進行Real-time PCR。Real-time PCR按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進行，反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL，加H2O 7 μL補至20 μL，反應在Applied Biosystems公司的7900HT Fast Real-time PCR system上進行，每一樣品均設3個重復孔，以GAPDH作為內參。RUNX2引物序列：Forward TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT、Reverse TGCTTTGGTCTTGAAATCACA。OSX引物序列：Forward CCTCCTCAGCTCACCTTCTC，Reverse GTTGGGAGCCCAAATAGAAA。OCN引物序列：Forward AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT，Reverse GCGCCTGGGTCTCTTCACT。GAPDH引物序列：Forward GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse GAGATGGTGATGGGATTTC。

1.8 統計學分析

所有數據均使用SPSS統計軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 R-spondin1對 hBMSC Wnt信號通路的影響

雙熒光素酶報告基因檢測系統結果顯示R-spondin1能夠以劑量依賴的方式激活Wnt信號通路，見圖1A。Western blot 檢測結果顯示 R-spondin1能夠以劑量依賴的方式增強Wnt信號通路下游靶基因β-catenin蛋白表達，見圖1B。

注：A為熒光素酶實驗結果，B為Western blot 檢測結果

2.2 R-spondin1對hBMSC成骨分化的影響

R-spondin1顯著促進了ALP活性，鈣沉積，見圖2。R-spondin1顯著促進了OSX、OCN 和RUNX2 mRNA和蛋白的表達，見圖3。

注:A為ALP活性，B為鈣鹽沉積的定量，C為顯微鏡下鈣鹽沉積；(1)兩組比較，P<0.05

(1)兩組比較，P<0.05

3 討論

hBMSC是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，因其具有分離培養容易、增殖能力強和多向分化能力的優點成為再生醫學和組織工程領域研究最為深入的種子細胞之一。hBMSC是成骨細胞的前體細胞，在體外可以定向分化為骨細胞，其過程受到多種信號通路的調控，包括BMPs/Smad、MAPK和Wnt信號通路等[5]。

Wnt信號通路包括經典和非經典2種。經典的Wnt信號通路：即Wnt/β-catenin信號通路，Wnt配體(如Wnt3a)與受體FZD和輔助受體LRP結合后抑制APC復合物對β-catenin的降解，使β-catenin在細胞內富集并入核與Tcf/Lef形成轉錄激活復合物，促進下游基因的轉錄[6]。非經典的Wnt信號通路：Wnt配體(如Wnt11)與受體FZD和輔助受體ROR2/RYK結合后，激活下游JNK、CaMKII、PKC信號通路。研究發現經典的Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路在hBMSC成骨分化過程中均發揮著重要的作用[7]。Qin等[4]發現使用Wnt3a激活經典的Wnt信號通路，能夠顯著增強hBMSC中ALP活性，同時抑制脂滴形成，進一步研究證實了經典的Wnt信號通路能夠通過促進RUNX2的表達從而促進hBMSC的成骨分化。研究發現在間充質干細胞敲除β-catenin基因，能夠抑制成骨分化，進一步說明了經典的Wnt信號通路在hBMSC成骨分化過程中發揮著重要的作用[8]。Fu等[9]發現非經典Wnt/JNK通路也能促進hBMSC的成骨分化能力。

R-spondin1是Wnt信號通路的激活劑，既能激活經典的Wnt信號通路，也可以激活非經典的Wnt信號通路[10]。由于經典的Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路在hBMSC成骨分化過程中均發揮著重要的作用，因此R-spondin1能夠促進hBMSC的成骨分化能力。本研究結果證實了該推測，R-spondin1對早期成骨分化指標ALP活性和成骨分化晚期鈣沉積都有顯著的增強作用，進一步在分子水平上證明R-spondin1能夠促進成骨分化標志物OSX和OCN的表達，并初步證明對RUNX2表達的促進作用可能是R-spondin1促進hBMSC成骨分化的原因。

[1] Guoping W，Xiaochuan H，Zhihui Y，et al．Influence on the osteogenic activity of the human bone marrow mesenchymal stem cells transfected by liposome-mediated recombinant plasmid pIRES-hBMP2-hVEGF165 in vitro[J]．Annals of plastic surgery， 2010(1)：80-84．

[2] De Lau WB，Snel B，Clevers HC．The R-spondin protein family[J]．Genome Biol， 2012(3)：242．

[3] de Lau W，Peng W C，Gros P，et al．The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module： regulator of Wnt signal strength[J]．Genes & development， 2014(4)：305-316．[4] Shen YL，Luo Q，Guo YX，et al．Bone marrow mesenchymal stem cell-derived Wnt5a inhibits leukemia cell progression in vitro via activation of the non-canonical Wnt signaling pathway[J]．Oncol Lett， 2014(1)：85-90．

[5] 張新昌，張西正．骨髓間充質干細胞成骨分化相關通路的研究進展[J]．醫學綜述， 2013(21)：3853-3856．

[6] 尹定子，宋海云．Wnt信號通路：調控機理和生物學意義[J]．中國細胞生物學學報， 2011(2)：103-111．

[7] 陳小靜，高艷虹．Wnt信號通路調控間充質干細胞成骨分化的研究進展[J]．上海交通大學學報：醫學版， 2013(1)：99-103．

[8] Cai SX，Liu AR，Chen S，et al．Activation of Wnt/β-catenin signalling promotes MSCs to repair injured alveolar epithelium induced by LPS in mice[J]．Stem Cell Res Ther， 2015(1)：65．

[9] Fu L，Tang T，Miao Y，et al．Activation of non-canonical Wnt/JNK pathway by Wnt3a is associated with differentiation fate determination of human bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells[J]．Biochem Biophys Res Commun， 2011(1)：98-104．

[10]Hao HX，Xie Y，Zhang Y，et al．ZNRF3 promotes Wnt receptor turnover in an R-spondin-sensitive manner[J]．Nature， 2012(7397)：195-200．

(2015-03-23收稿，2015-04-19修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 周 凌

R-spondin1 Promotes Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

SUN Bo1， ZHANG Tao2， YANG Long1， LI Jing1， REN Houxiang1， SUN Qi1， WANG Jianji1, YE Chuan1

(1．GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004，Guizhou，China; 2．DepartmentofOrthopedics,the117thHospitalofPLA,Hangzhou311201,Zhejiang,China)

Objective: To investigate the effect of R-spondin1, a Wnt signal pathway activator, on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSC). Methods: hBMSC were treated with 0, 5, 10, 20 μg/L R-spondin1. Luciferase assay was employed to detect the effect of R-spondin1 on Wnt signal pathway, and Western blot was used to detect the expression of β-catenin which was the downstream target gene of Wnt signal pathway. Alkaline phosphatase(ALP) activity, calcium deposition, and the levels of OSX,OCN, RUNX2 were detected to observe the effect of R-spondin1 on hBMSC osteogenic differentiation. Results: R-spondin1 enhanced Wnt signal pathway, ALP activity, calcium deposition and the expression of OSX，OCN and RUNX2 in hBMSC osteogenic differentiation. Conclusion: R-spondin1 can enhance Wnt signal pathway of hBMSC and promote osteogenic differentiation.

R-spondin1；Wnt signal pathway；Human bone marrow mesenchymal stem cells；Osteogenic differentiation；RUNX2

國家自然科學基金資助項目[81360232]； 貴州省衛生廳資助項目[gzwkj2010-1-042]； 貴州省國際科技合作項目[黔科合外G字2010-7]； 貴州省科技廳社發聯合基金項目[黔科合20103166]

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1226.004.html

R318.17

A

1000-2707(2015)05-0438-04

**貴陽醫學院2012級碩士研究生

***通信作者 E-mail:yechuanchina@hotmail.com