TBX2和MDM2在子宮內膜樣腺癌中的表達及相關性

郭真理，陳 柯，徐 傲，杜 軍，沈 倩

(安徽省立醫院南區病理科，安徽合肥 230001)

原癌基因的異常激活在子宮內膜樣腺癌發生中發揮重要作用。生理情況下原癌基因編碼的蛋白質對正常細胞的生長與分化起正性調控作用，各種致癌因素的作用會使正常細胞內處于正常或有限表達的原癌基因被激活為有致癌活性的癌基因。相關癌基因TBX2與MDM2相互協同調控結腸腺癌及乳腺癌等腺癌發生發展已有一些研究，而同時檢測二者在子宮內膜樣腺癌中的表達及相關性報道不多，我們運用免疫組化SP法檢測TBX2與MDM2蛋白在92例子宮內膜樣腺癌中的表達情況，初步探討其表達變化在腫瘤發生發展進程中的作用及對腫瘤靶點尋求及預后判斷的意義。

1 材料與方法

1．1 標本來源及處理 選取安徽省立醫院本部及南區病理科2001年9月—2012年10月經中性甲醛固定及石蠟包埋的子宮內膜樣腺癌標本92例，患者年齡38～72歲，平均55歲，依據國際婦產科聯盟(FIGO)2000年的標準對子宮內膜樣腺癌進行手術病理分期:Ⅰ期者35例，Ⅱ期者30例，Ⅲ期者27例;其中病理分級為G1級(高分化)者35例，G2級(中分化)者40例，G3級(低分化)者17例;肌層浸潤為≤1/2者45例，＞1/2者47例;淋巴結轉移為發生者27例，未發生者65例。同時選取因其它緣故如診斷性刮宮或子宮肌瘤實行手術的子宮病患存檔蠟塊標本，其中子宮內膜正常增生期30例，單純性增生30例，復雜伴不典型性增生30例，所有標本均經兩名具有高級職稱的病理專家復核診斷，所有病患術前均未進行放化療或激素類內分泌治療。

1．2 組織芯片制備 首先復查HE切片選取富集腫瘤細胞的區域，其次標記上述選定區域對應的蠟塊位點，再次用組織芯片儀制作空心蠟模，最后用組織芯片取樣器在蠟塊標記位點取出目標組織并放入空心蠟模中，構建8×7點陣的組織微陣列。對組織芯片蠟塊行3μm厚連續切片，并裱褙于購自北京中杉金橋生物公司的陽離子防脫片上行相關染色。

1．3 主要試劑與方法 即用型MDM2鼠抗人單克隆抗體(ZM－0425)及通用型二步法試劑盒(PV－6000)均購自北京中杉金橋生物公司;濃縮型TBX2鼠抗人單克隆抗體由北京中杉公司代購，工作液濃度為1∶100。方法采用SP法:切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓加熱修復抗原，3%過氧化氫阻斷，其余步驟按說明書依次進行。用既往TBX2與MDM2陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1．4 免疫組織化學結果判定 以細胞核和(或)細胞漿出現黃色、棕黃色及棕褐色為陽性，與背景顏色一樣或無著色為陰性。結果選用半定量積分法［1]判讀:首先依陽性細胞在視野中占百分比評分:陰性為0，陽性細胞≤10%為1分，11% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分;其次依染色強度評分:無色為0，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時考慮背景著色。兩項得分之積:陰性(－)為0～4分，弱陽性(1+)為4～5分，中陽性(2+)為6～8分，強陽性(3+)為9～12分。

1．5 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件分析，率的比較采用χ2檢驗，Fisher's精確概率法用于判斷樣本差異的顯著性，TBX2與MDM2蛋白之間的相關性用Spearman等級相關分析。

2 結果

2．1 TBX2和MDM2在良惡性病變子宮內膜中表達 見表1。TBX2與MDM2蛋白在正常增生期內膜多呈陰性表達(圖1，圖2);TBX2蛋白主要表達于子宮內膜樣腺癌細胞質，少量胞核表達(圖3);MDM2陽性表達主要位于子宮內膜樣腺癌細胞核(圖4)。從子宮內膜正常增生期到子宮內膜樣腺癌，TBX2和MDM2的陽性表達率漸次升高。χ2檢驗顯示子宮內膜樣腺癌中TBX2陽性表達率(76．1%)顯著高于正常增生期內膜及單純性增生內膜(30．0%;36．7%)，亦顯著高于復雜伴不典型增生內膜(43．3%)，差異均具有統計學意義(P＜0．01)。而復雜伴不典型增生組織相較正常增生期內膜表達差異沒有顯著性(P＞0．05);χ2檢驗顯示子宮內膜樣腺癌中MDM2蛋白表達與正常增生期內膜、單純性增生及復雜不典型性增生內膜組間差異有顯著性(P均＜0．01)，復雜伴不典型性增生與正常增生期內膜差異亦有顯著性(P＜0．01)，與單純性增生內膜差異沒有顯著性(P ＞0．05)。

表1 TBX2和MDM2在不同子宮內膜組織中的表達

2．2 TBX2和MDM2表達與臨床病理參數的關系

見表2。TBX2陽性表達與子宮內膜樣腺癌病理學分級高低、肌層浸潤深淺及臨床分期高低均有關(χ2=11．143，P ＜0．01;χ2=9．306，P ＜0．01;χ2=8．276，P ＜0．05)，與淋巴結轉移與否無關(χ2=3．442，P ＞0．05);MDM2陽性表達率與子宮內膜樣腺癌病理學分級高低、肌層浸潤深淺無關，與臨床分期高低、淋巴結轉移與否也不具相關性(χ2=1．964，χ2=2．081，χ2=3．867，χ2=1．377，P 均 ＞0．05)。

表2 子宮內膜樣腺癌中TBX2和MDM2的表達與臨床病理參數的關系

2．3 TBX2和MDM2表達的相關性 Spearman等級相關分析顯示子宮內膜樣腺癌中TBX2與MDM2蛋白表達呈正向相關性(rs=0．346，P ＜0．01)。

圖1 TBX2蛋白在正常增生期內膜中的表達呈陰性

圖3 TBX2蛋白在子宮內膜樣腺癌中主要表達于細胞漿，少量胞核表達

圖4 MDM2蛋白在子宮內膜樣腺癌中主要表達于細胞核，均為SP法，高倍放大

圖2 MDM2蛋白在正常增生期內膜中的表達呈陰性

3 討論

TBX2是T－BOX基因家族重要組員，TBOX區為其特有的結構，在生物體內主要有調控發育的作用，屬發育調控相關基因。其編碼蛋白主要通過羧基末端的抑制轉錄結構域發揮阻遏作用。TBX2廣泛表達于各種組織的胚胎發育過程，能夠指導胚胎以及組織器官軸向發育［2－3]。TBX2可由多條途徑參與腫瘤的形成過程，首先，P19ARF－MDM2－P53通路是體內與細胞衰老有關的重要作用軸，而TBX2可通過抑制P19ARF的表達封閉細胞衰老途徑，抑制細胞凋亡發生，當TBX2的異常累積到一定程度會導致細胞的惡性變［4]。其次，與 myc、sis等經典癌基因協同作用，使細胞過度增殖惡化［5]。再次，可以與P21基因啟動子區結合抑制P21基因的表達并使其在DNA損傷后不能發揮誘導作用［6]。此外，新近研究［7]還發現TBX2能夠干擾抑癌基因PRb的轉錄從而使其對細胞周期進程失去控制能力。研究表明TBX2蛋白在多種人類惡性腫瘤如胰腺癌、乳腺癌等中均呈高表達［8－9]。本實驗發現92例子宮內膜樣腺癌中TBX2陽性表達率(76．1%，70/92)顯著高于30例正常增生期內膜及30例單純性增生內膜(30．0%，9/30;36．7%，11/30)，亦顯著高于復雜伴不典型增生內膜(43．3%，13/30)，差異均具有統計學意義(P＜0．01)。而相較正常增生期內膜而言，在復雜伴不典型增生組織中表達雖有上升勢頭，但沒有統計學意義。這與本課題組之前［10]做72例子宮內膜樣腺癌標本的研究結果一致，樣本量的擴大仍然支持上述結果，增加了可信度。而且與其他學者［11]的研究結果也基本吻合。可以看出，TBX2陽性表達率在子宮內膜病變前期(單純性增生及復雜伴不典型增生階段)與正常增生期內膜差別不大，而到了病變后期(腺癌發生階段)其表達率卻發生陡然升高，提示TBX2基因活化主要發生在子宮內膜病變晚期。本次還發現TBX2陽性率隨著病理學分級的變低及肌層浸潤的加深而增高，差異均有統計學意義(P均＜0．01)，即低分化的癌變組織中高表達，高分化的癌變組織中低表達;肌層深浸潤的腫瘤組織中表達更強，肌層淺浸潤的腫瘤組織中表達相對弱些。這可能與TBX2抑制P19ARF從而阻遏細胞衰老抑或干擾PRb轉錄使細胞周期和分化不能正常進行有關。另外TBX2表達情況與臨床分期之間的差異亦有顯著性(P＜0．01)，即高分期的病人TBX2表達較高，低分期的患者表達稍弱。而臨床分期是臨床上判斷病患預后情況的重要參考指標，臨床分期的增高往往預示著病人情況不理想，發生遠處多部位轉移可能性較大，預后較差。上述結果提示TBX2陽性高表達使癌組織易于突破基底膜向肌層及更遠處浸潤性生長，提升了癌組織侵襲能力，促進了子宮內膜樣腺癌向增殖更快、惡性程度更高方向演進。故而TBX2基因具有癌基因顯著特征，與腫瘤的浸潤侵襲密切相關，為腫瘤的預后評估與生物治療提供了新的關鍵因子。

MDM2是一種進化保守基因，位于人染色體12q13－14，在體內作為一種轉錄因子發揮作用，可以自發誘導癌變形成，正常人體多個組織器官均可見其表達。MDM2處于P19ARF－MDM2－P53作用軸的核心，在體內其主要和野生型P53(wtP53)之間通過負反饋調節環進行相互作用［12]，也就是說，wtP53可以促進MDM2的轉錄，使MDM2蛋白表達變高;同時過表達的MDM2蛋白又可與wtP53結合在一起發揮降低其轉錄活性的作用，阻遏了wtP53基因的轉錄激活功能，并使wtP53蛋白表達水平維持在低水平。除了wtP53以外，MDM2還可抑制被wtP53活化的下游基因P21的抑制細胞增生作用。另外MDM2還能夠通過增強Rb相關的E2F－I聚合物的加快生長作用等非wtP53依賴方式調控細胞的增殖和凋亡［13]。本次實驗我們加大樣本量發現MDM2陽性表達率在30例正常增生期內膜中顯著低于92例子宮內膜樣腺癌(P＜0．01)，在30例復雜不典型增生中亦明顯低于92例子宮內膜樣腺癌(P＜0．01)。并且在30例子宮內膜正常增生期組織中亦顯著低于30復雜不典型性增生內膜(P ＜0．01)，這與我們之前［14]癌變組織較少時的研究一致，提示高表達的MDM2蛋白在子宮內膜病變剛開始時就已經存在，MDM2基因異常激活在腫瘤進程中屬于早期事件。另本研究還發現MDM2陽性表達率隨著子宮內膜樣腺癌病理學分級的降低及肌層浸潤加深發生有增高勢頭，臨床分期較高者表達亦高于較低者，淋巴結轉移發生者相較未發生轉移者表達亦相對高些，但統計學上均無意義。另外有學者［15]研究子宮內膜樣腺癌亦發現MDM2陽性表達率與病理學分級的差異有統計學意義，與腫瘤臨床分期、肌層浸潤及淋巴結轉移的差異沒有統計學意義。綜上說明MDM2基因活化始發于子宮內膜組織病變早期，在促進子宮內膜細胞從正常增生狀態變成不典型增生，從不典型增生到高分化癌變中發揮至關重要的作用。單從本實驗看，其在腫瘤后期惡化演進發展中的作用不是太明顯，但并不代表其高表達不可進一步促進腫瘤侵襲，因為我們的實驗只做了蛋白層次，而且還可能有誤差的存在，故而需要進一步加深研究。

本次我們在92例子宮內膜樣腺癌標本中研究TBX2與 MDM2蛋白的表達關系，得出 TBX2與MDM2蛋白表達呈正相關關系。與宋一村等［16]在45例子宮內膜樣腺癌標本中的研究相符合。另外二者其在結腸腺癌和乳腺癌［17－18]等腺癌中的研究也是正向相關。提示兩者在腫瘤特別是腺癌演進中起協同作用，其聯系可能是TBX2通過阻遏P19ARF蛋白表達促進MDM2較強表達，亦有可能是內在結構有配套作用位點甚或其他相關途徑。我們目前只用了免疫組化方法，具體機制還搞不清，需要進一步加深實驗研究。不管機理如何，有一點是可以肯定的，即TBX2與MDM2在腺癌中起著癌基因的作用，當某些致癌因素有效活化它們后，可使級聯反應的相關蛋白激活，引起正常細胞過度增殖后惡變聚積形成腫瘤。同時加速腫瘤侵襲和進展，子宮內膜樣腺癌的侵襲轉移過程接受多種基因調控，尤其在向肌層浸潤時，當TBX2與MDM2都高表達形成合力，對肌層具有極強的破壞性。總之，TBX2與MDM2蛋白都高表達可提示腫瘤惡性程度較高和預后不佳，至于其能不能作為有用的生物標記分子或是基因治療靶點，可能還需要更多的研究。

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