奧拉西坦注射液有關物質分析方法及穩定性研究

胡 雪，余 捷

(1．武漢市第十一醫院，武漢市紅十字會醫院藥劑科，湖北武漢 430015;

2．武漢市第一醫院門診藥劑科，湖北 武漢 430022)

1974年由意大利史克比切姆公司最先合成，是一種促智藥［2]，目前上市劑型有片劑和注射液，奧拉西坦注射液于1990年在意大利上市，規格為5 mL∶1 g，奧拉西坦藥理作用廣泛，可有效改善患者的記憶學習能力［3－4]，臨床上用于腦損傷及引起的神經功能缺失、記憶與智能障礙等癥的治療［5－6]，特別對預防老年人癡呆癥有顯著療效［7]。目前國內已經有多家廠家生產奧拉西坦注射液，商品名有“歐蘭同”，“倍清星”等。本文使用氰基鍵合硅膠柱建立了高效液相色譜法檢測奧拉西坦注射液的有關物質，并對奧拉西坦注射液進行了影響因素試驗和加速試驗，考察了奧拉西坦注射液的穩定性。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 BT124S型十萬分之一分析天平(Sartorius公司);UV2600紫外分光光度計(島津);pHS－3C酸度計(上海精科);LC－10AT島津高效液相色譜儀(LC－10AT泵、SPD－10A紫外檢測器，日本島津株式會社，配有島津工作站)。

1．2 試藥 奧拉西坦對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號101032－201301);奧拉西坦注射液(自制，規格 5 mL∶1．0 g，批號 140607，140618，20140701，20140702，20140703);磷酸氫二鉀(分析純，天津市大茂化學試劑廠);乙腈(色譜純，美國Fisher)，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱:氰基鍵合硅膠柱 (300 mm×4．6 mm，填料孔徑 5μm);流動相;乙腈 －5 mmol·L－1;磷酸氫二鉀－(5∶95)(用磷酸調節pH值至 5．0);檢測波長:214 nm;柱溫:室溫;流速:0．6 mL·min－1;進樣量:20 μL。

2．2 樣品處理 精密量取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含奧拉西坦0．5 mg的溶液，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1．0 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取對照溶液20μL，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10% ～20%;再精密量取取供試品溶液與對照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液中如顯雜質峰，水解產物(相對保留時間約為0．8)峰面積不得大于對照主峰面積的1/2(0．5%)，各雜質峰面積的和:不得大于對照溶液的主峰面積(1．0%)。

2．3 專屬性考察 分別按“2．2”中方法配置對照品溶液和供試品溶液，同時按該方法配置奧拉西坦注射液處方比例的空白溶劑，空白輔料溶液，按“2．1”中色譜條件進行樣品測定。色譜圖見圖1，由色譜圖可知，奧拉西坦主峰與相鄰雜質峰分離度為4．0，大于 1．5，空白溶劑和輔料均不出峰，不干擾本品有關物質的檢查。表明該色譜條件適用于本品有關物質的檢查。

圖1 奧拉西坦注射液有關物質檢測專屬性考察圖譜

2．4 破壞試驗 取奧拉西坦注射液(批號:140607)5．0 mL，置200 mL瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。精密稱取按處方配制的空白輔料63．0 mg，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過;精密量取續濾液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為空白輔料貯備液。分別量取供試品貯備液和空白輔料貯備液各5 mL進行如下處理:(1)加1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液1 mL，水浴加熱1．0 h，放冷，用1 mol·L－1鹽酸溶液調節pH值至中性，將溶液轉移至50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。(2)加0．1 mol·L－1的鹽酸溶液 1 mL，水浴加熱 1．0 h，放冷，用0．1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，將溶液轉移至50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。(3)水浴加熱3．0 h，放冷，將溶液轉移至50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。(4)置50 mL量瓶中，于照度為(4 500±500)Lx的條件下放置6 h，用流動相稀釋至刻度，搖勻。(5)置50 mL量瓶中，加雙氧水1μL，室溫放置2．0 h，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

上述溶液濾過取續濾液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖即得堿、酸、高溫、光照、氧化破壞色譜圖。由圖可知，本品經堿、酸、高溫、光照、氧化破壞試驗后降解產物均能與奧拉西坦有效分離，主峰純度良好，理論塔板數、分離度均符合規定，說明該色譜條件適用于本品有關物質檢查。

2．5 線性關系試驗 精密稱取奧拉西坦對照品28．00 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。分別精密量取對照品貯備溶液 0．05、0．1、0．2、0．5、0．8、1．0、1．5、1．8 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以奧拉西坦對照品峰面積A為縱坐標，以奧拉西坦濃度C(mg·L－1)為橫坐標進行線性回歸，得線性方程A=227 45C－883．11，相關系數 r=0．999 8。結果表明奧拉西坦在0．28 ～10．08 mg·L－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積線性關系良好。

2．6 量限和檢測限試驗 精密稱取奧拉西坦對照品25．00 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，逐級稀釋，精密量取溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以檢測器信號/儀器噪音(S/N)=10時為定量限，以檢測器信號/儀器噪音(S/N)=3時為檢測限，經測定奧拉西坦的定量限和檢測限分別為1．32 ng和0．45 ng。

2．7 精密度試驗 精密稱取本品(批號:140607)適量，按2．2中對照品溶液配制方法配制樣品，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續重復進樣6次，奧拉西坦樣品峰面積相對標準偏差為0．81%。試驗結果表明本法精密度良好。

2．8 溶液穩定性試驗 分別精密量取本品(批號:140607)適量，加流動相稀釋制成每1 mL約含奧拉西坦0．5 mg的溶液，作為供試品溶液。放置與室溫(25 ℃)條件下，分別于第 0、1、2、4、6、8 h 時，精密量取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩定性。試驗結果見表1。

表1 奧拉西坦注射液有關物質檢查溶液穩定性試驗

由試驗結果可知，供試品溶液在25℃條件下放置8 h，與0 h比較，單雜和總雜變化不大，主峰面積基本無變化，說明有關物質檢查供試品溶液在室溫(25℃)條件下放置8 h內穩定。

2．9 有關物質測定 精密量取本品適量，按2．2中樣品處理方法配置供試品溶液和對照品溶液;按2．1中色譜條件測定樣品有關物質。各批樣品及測定結果見表2。

表2 奧拉西坦注射液有關物質檢查結果

以上試驗結果表明，自制奧拉西坦注射液多批產品水解產物、總雜質均控制在較小范圍內。

2．10 穩定性考察 參照中國藥典2015版附錄XIXC原料藥與藥物制劑穩定性試驗指導原則，對自制奧拉西坦注射液(批號20140701)進行影響因素試驗，影響因素試驗條件為高溫60℃，高溫40℃。光照(4500±500)Lx以及低溫4℃，樣品使用棕色玻璃安瓿瓶包裝，于0、5、10 d檢測樣品有關物質，結果見表3。同時對自制奧拉西坦注射液(批號20140701、20140702、20140703)進行加速試驗，加速試驗條件為(40±2)℃，相對濕度(75±5)%，于0、1、2、3、6 月檢測樣品有關物質，結果見表4。

表3 奧拉西坦注射液影響因素試驗有關物質檢查結果

表4 奧拉西坦注射液加速試驗有關物質檢查結果

3 討論

文獻報道奧拉西坦注射液有關物質檢測方法多為等度洗脫和梯度洗脫高效液相色譜法等，檢測用色譜柱有 C8柱、C18柱［8－11]、氨基柱［12－13]以及氰基柱［14]等。使用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內對奧拉西坦進行光譜掃描，發現奧拉西坦為末端吸收，參照奧拉西坦原料標準確定采用214 nm作為檢測波長。實驗中對流動相進行了摸索，水相使用純化水時樣品容易渾濁，并且色譜圖中奧拉西坦峰存在拖尾現象，通過使用磷酸氫二鉀水溶液作為水相可以避免色譜峰拖尾，獲得對稱性良好的色譜峰，并且沒有渾濁現象，奧拉西坦峰與相關雜質的分離效果良好。

通過對自制奧拉西坦注射液進行影響因素試驗，發現樣品在高溫，低溫，光照條件下有關物質均較穩定，說明自制制劑的制備工藝是合理的，加速試驗6個月結果表明藥物在6個月內有關物質呈上升趨勢，但是變化不大，變化幅度均在要求范圍內，進一步說明產品工藝的合理性及產品的穩定性，同時還需要通過性狀，含量，澄明度等的穩定性考察情況進一步確定自制奧拉西坦注射液的穩定性。

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