HPLC-ELSD法同時測定三葉青中胡蘿卜苷和β-谷甾醇的含量

丁 麗，章璐幸，邱 彥

(1．浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，浙江寧波 315100;2．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361102)

三葉青為葡萄科植物三葉崖爬藤(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)的干燥塊根，是浙江民間常用藥之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，三葉青具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、保肝及抗腫瘤等作用［1－7]。三葉青中含有酚類、糖類、黃酮類、甾體類及油脂類等多種成分［8－9]，其中，胡蘿卜苷具有免疫調(diào)節(jié)作用［10]，而 β-谷甾醇具有降血脂、抗腫瘤、抗炎等作用［11－12]。谷甾醇是胡蘿卜苷的苷元，課題組在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，二者在三葉青中的含量較接近，已有文獻報道三葉青中β-谷甾醇的含量測定［13]，但未見有同時測定三葉青中此2種成分的報道。本實驗采用HPLC-ELSD法同時測定三葉青中胡蘿卜苷和β-谷甾醇的含量，為三葉青藥材質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);蒸發(fā)光散射檢測器(Agilent 380);XS 1050DU型電子分析天平(Mettler Toledo公司)。

β-谷甾醇對照品(中國食品藥品生物制品檢定所，批號110851－201407，純度≥98%);胡蘿卜苷對照品(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號20140926，純度≥98%);甲醇(色譜純);三葉青藥材分別購自杭州市和寧波市各藥店，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥系楊雄志教授鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et．Gilg的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為島津VPN-ODSC18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相為甲醇;體積流量為0．7 mL ·min－1，柱溫為30℃;進樣量20μL;蒸發(fā)光檢測器，以氮氣為載氣，漂移管溫度60℃，體積流量1．8 L·min－1。理論塔板數(shù)按胡蘿卜苷計不低于4 000，分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和三葉青藥材(B)HPLC色譜圖

2．2 對照品溶液的制備 取胡蘿卜苷和β-谷甾醇對照品適量，精密稱定，置于100 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即制成含胡蘿卜苷0．05 g ·L－1和 β-谷甾醇0．1 g·L－1的混合對照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 將三葉青藥材粉碎，過30目篩，取粗粉約3 g，精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，加入乙酸乙酯50 mL，水浴加熱回流6 h，趁熱過濾，取濾液，旋干溶劑，殘渣用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度。

2．4 線性關(guān)系 分別精密吸取混合對照品溶液2．0、5．0、10．0、20．0、30．0、40．0 μL，按“2．1”項色譜條件測定峰面積，以峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(Y)、對照品所進質(zhì)量的常用對數(shù)為橫坐標(X)，進行線性回歸，得胡蘿卜苷的回歸方程為Y=0．696X+2．737，r=0．999 7;β-谷甾醇的回歸方程為 Y=0．752 X+2．909，r=0．999 6。結(jié)果表明，胡蘿卜苷在進樣量為0．1～2．0 μg線性關(guān)系良好，β-谷甾醇在進樣量為0．2～4．0μg線性關(guān)系良好。

2．5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20μL，按“2．1”項色譜條件，重復(fù)進樣6次。以胡蘿卜苷和β-谷甾醇的峰面積計算，RSD分別為 1．64%、0．55%。

2．6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(廣西)，按“2．1”項色譜條件，在制備后 0、2、4、6、8、10、12 h后分別進樣，以胡蘿卜苷和β-谷甾醇峰面積計算，結(jié)果RSD分別為1．79%、1．13%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．7 重復(fù)性試驗 取廣西產(chǎn)三葉青粗粉，按“2．3”項下方法，制備6份供試品溶，按“2．1”項色譜條件測定，測得結(jié)果胡蘿卜苷和β-谷甾醇的平均質(zhì)量分數(shù)分別為 0．062 mg·g－1和 0．154 mg·g－1，RSD 分別為2．03%和 1．36%。

2．8 加樣回收率試驗 取廣西產(chǎn)三葉青藥材1．5 g粉碎，過30目篩，精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，加入含 0．050 20 g·L－1胡蘿卜苷和 0．1153 g·L－1β－谷甾醇的混合對照品溶液2 mL，按“2．3”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2．1”項色譜條件測定，計算胡蘿卜苷和β-谷甾醇的加樣回收率分別為99．32%和100．13%，RSD分別為1．71%和 1．43%。

2．9 樣品測定 取不同產(chǎn)地的藥材，按“2．3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄胡蘿卜苷和β-谷甾醇的峰面積，取“2．2”項下對照品溶液，分別進樣10、20μL。按外標二點法計算胡蘿卜苷和β-谷甾醇的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 三葉青藥材中胡蘿卜苷和β-谷甾醇測定結(jié)果

3 討論

本實驗考察了安捷倫ZORBAX SB－ODSC18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)和島津 VPN －ODSC18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，結(jié)果表明后者能獲得較好的峰形與分離度。選擇流動相時，比較了甲醇－水、乙腈－水和甲醇3種流動相，結(jié)果以甲醇分離效果最佳。本實驗還考察了丙酮、乙酸乙酯、70%乙醇、95%乙醇4種有機溶劑的提取效率，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取藥材中的兩種成分含量均較高;同時對提取方式、提取時間、物料比進行了考察，得出最佳提取條件。

三葉青藥材化學(xué)成分較多，目前主要以黃酮類成分研究居多［14－15]。本實驗選取胡蘿卜苷和β－谷甾醇2種指標成分作為三葉青藥材的評價依據(jù)，對5個產(chǎn)地的三葉青藥材中胡蘿卜苷和β－谷甾醇進行定量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn):浙江產(chǎn)三葉青中胡蘿卜苷和β-谷甾醇的含量均較其他產(chǎn)地高，2種成分含量的高低與三葉青藥材藥理作用的相關(guān)性有待進一步研究。本方法簡便，結(jié)果準確、可靠，可作為三葉青藥材中胡蘿卜苷和β-谷甾醇的測定方法，為三葉青的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

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