加校正因子的主成分自身對照法測定奧硝唑片和膠囊中有關物質含量

耿慶光，王 發

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安 710061)

奧硝唑是繼甲硝唑、替硝唑后上市的抗厭氧菌和抗滴蟲藥物，其抗厭氧菌和抗原生質感染、抗毛滴蟲的作用均高于前兩者。臨床上用于毛滴蟲引起的男女泌尿生殖道感染，阿米巴原蟲引起的腸、肝阿米巴蟲病，賈第鞭毛蟲病，厭氧菌感染、術后感染和口腔感染等。奧硝唑的耐受性良好，不良應較少，有皮膚過敏反應、消化系統反應、循環系統反應等［1－3]?！吨袊幍洹?010年版第二增補本奧硝唑片和膠囊采用自身對照法測定有關物質［4]，限度為雜質總量不得超過1．0%。但原料項下有關物質的測定為:雜質Ⅰ按外標法以峰面積計算，不得超過0．2%，其它各雜質和不得超過0．5%。為比較兩種方法之間的差異，我們對收集到的137批奧硝唑制劑(片劑和膠囊兩種劑型)按標準對有關物質項進行了測定，分別用主成分自身對照法和外標法對雜質Ⅰ進行計算，結果自身對照法的計算結果比外標法的大，為更加準確的控制奧硝唑制劑中有關物質的含量，參考相關文獻資料［5－9]，建立了加校正因子的主成分自身對照法測定奧硝唑片和膠囊中有關物質含量的方法，具體方法和結果如下。

1 儀器與試藥

1．1儀器 島津 LC-30AD色譜儀，UV檢測器，賽多利斯BBS-224S型電子分析天平。

1．2 試劑和樣品 雜質Ⅰ對照品(2-甲基-5-硝基咪唑)，中檢所提供，批號:100512－200802，含量99．8%;奧硝唑對照品，中檢所提供，批號:100608－201102，含量100．0%;137批奧硝唑制劑分別由9個企業提供;試劑:甲醇為色譜純，水為高純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱:Agilent C18(250 mm×4．6 mm，5μm);流動相:甲醇—水(20 ∶80);檢測波長:318 nm;柱溫:35℃，流速:1．0 mL·min－1，進樣體積:20μL，記錄色譜圖至主峰保留時間的1．5倍。

2．2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液的制備 精密稱取供試品細粉適量(約相當于奧硝唑100 mg)，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．2 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．3 對照品溶液的制備 精密稱定雜質Ⅰ對照品9．99 mg(實際含雜質Ⅰ為9．97 mg)，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻，再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．4 系統適應性溶液的制備 取供試品溶液適量，加熱回流1 h，放冷至室溫，與對照品溶液1∶1混合即得。

2．3 系統適應性試驗 取“2．2”項下系統適應性溶液，照“2．1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，各色譜峰分離度符合要求。典型色譜圖見圖1。

2．4 檢測限 取雜質Ⅰ對照品溶液，用流動相逐步稀釋，按“2．1”項下色譜條件進樣測定，確定雜質Ⅰ的檢測限為0．019 94 mg·L－1(信噪比約為3)。

2．5 重復性試驗 取奧硝唑片和膠囊各一批，分別測定6次，測得雜質Ⅰ的含量分別為0．055%和0．039%，RSD 分別為1．9%和2．3%，表明方法重復性良好。

圖1 典型色譜圖

2．6 回收率試驗 精密稱取上述奧硝唑片和膠囊細粉適量(約含奧硝唑100 mg)6份，各精密加入對照品溶液250 μL(相當于雜質Ⅰ:0．05 μg)，按2．2項下方法制備相應溶液，測定，按外標法計算回收率，結果雜質Ⅰ的回收率為 99．1% 和 99．5%，RSD 為 3．3%和2．9%，表明方法回收率良好。

2．7 樣品的測定 按“2．2”項下方法，分別制備對照溶液、對照品溶液和樣品溶液，分別進樣20μL，記錄色譜圖至主峰保留時間的1．5倍。分別按照外標法，主成分自身對照法對檢出的雜質Ⅰ進行計算。結果顯示主成分自身對照法的計算結果比外標法的大，測定結果見圖2。

圖2 外標法和自身對照法計算樣品中雜質Ⅰ的結果比較

2．8 響應因子的測定 精密稱奧硝唑對照品10．46 mg，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，精密量取上述溶液和對照品貯備液各5 mL，同置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻。精密量取此混合溶液適量，用流動相稀釋成奧硝唑濃度為5．230 0、1．046 0、0．523 0、0．209 2、0．104 6 mg·L－1，雜質Ⅰ濃度為4．985 0、0．997 0、0．498 5、0．199 4、0．099 7 mg·L－1的系列對照品溶液，即得校正因子系列濃度溶液。依上述色譜條件進樣測定，記錄保留時間和峰面積，分別得到雜質Ⅰ和奧硝唑的線性方程，將各線性方程的截距校正為0，得校準方程的斜率。通過計算，得到的雜質Ⅰ校正因子為 0．80(f=k奧硝唑/k雜質Ⅰ);相對保留時間為0．23(RRT=tR雜質/tR奧硝唑)。

表1 奧硝唑和雜質Ⅰ的線性方程及校正因子

用校正因子對雜質Ⅰ的峰面積進行校正后計算，并與外標法計算的結果進行比較，結果顯示兩者比較一致，測定結果見圖3。

圖3 外標法和加校正因子的自身對照法計算樣品中雜質Ⅰ的結果比較

3 討論

《中國藥典》2010年版附錄ⅪⅩF藥品雜質分析指導原則指出:已知雜質對主成分的相對響應因子超出0．9～1．1范圍時，宜用對照品對照法計算含量，也可用經驗證的相對響應因子進行校正后計算，未知雜質的定量可用主成分的自身對照法計算［10]。本試驗測得的校正因子為0．8，因此采用主成分自身對照法測定奧硝唑制劑中雜質Ⅰ的含量，會使其結果偏高。為了保證檢驗結果的準確性，建議將奧硝唑制劑中有關物質檢查方法修改為:供試品溶液如檢出雜質Ⅰ(相對保留時間為0．23)，采用加校正因子的主成分自身對照法對其峰面積進行校正，校正因子為0．8，其他雜質采用不加校正因子的主成分自身對照法計算，各雜質峰面積的和不得大于自身對照溶液主峰的面積(1．0%)，以更準確的反映奧硝唑制劑中雜質的含量。

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［5] 魏嘉陵，林暢偉．用加校正因子的主成分自身對照法測定苯扎貝特中雜質氯苯酪胺的含量［J]．藥物分析雜志，2006，26(12):1848－1850．

［6] 郭福團．加校正因子的主成分自身對照法測定鹽酸苯海拉明片中有關物質的含量［J]．海峽藥學，2013，25(10):47 －49．

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［10]國家藥典委員會．中國藥典(二部)［S]．北京:中國醫藥科技出版社，2010:205．