CARTp 對(duì)腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能的影響

周彥君，劉麗冰，張 巖

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，山東濰坊261031）

CARTp 對(duì)腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能的影響

周彥君1，劉麗冰1，張 巖2

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，山東濰坊261031）

目的探討可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（CARTp）對(duì)不同時(shí)間段腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能的影響。方法將成年美國(guó)癌癥研究所雄性小鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（Sham組）、大腦中動(dòng)脈阻塞組（MCAO組）和CARTp處理組，每組15只。采用線栓法復(fù)制MCAO模型。CARTp處理組小鼠于缺血再灌注第2天經(jīng)尾靜脈注射CARTp（2.5μg/kg），以后每天注射2.5μg/kg至第10天；Sham組、MCAO組注射生理鹽水。通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分判斷神經(jīng)功能障礙程度。觀察并比較三組小鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能評(píng)分，判斷不同處理組小鼠的神經(jīng)功能障礙情況。結(jié)果MCAO組和CARTp處理組神經(jīng)功能評(píng)分均顯著高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CARTp處理組的神經(jīng)功能評(píng)分從第1天至第8天均低于MCAO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CARTp能減輕小鼠腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)功能障礙，并可能在腦神經(jīng)功能恢復(fù)中發(fā)揮重要作用，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CARTp減輕神經(jīng)功能障礙的作用明顯減弱。

腦缺血； 再灌注損傷； 苯丙胺； 可卡因； 神經(jīng)肽類(lèi)

腦是人體對(duì)缺血最為敏感的器官，腦組織缺血將會(huì)導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血時(shí)間長(zhǎng)短及殘存血流量的多少有關(guān)。缺血性腦卒中是指由于腦的供血?jiǎng)用}（頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱(chēng)。而腦最明顯的組織學(xué)變化是腦水腫及腦細(xì)胞壞死，并伴有相應(yīng)部位的臨床癥狀和體征，如偏癱、失語(yǔ)等可降低患者的生活質(zhì)量。缺血性腦卒中因其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率而極具危害性，其中缺血性腦血管病是現(xiàn)代社會(huì)致死致殘的主要原因之一，其治療原則是及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)的血液再灌注，而隨之而來(lái)的一大難題又是缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的一種常見(jiàn)病理生理過(guò)程，而腦缺血再灌注損傷是指腦缺血一定時(shí)間再恢復(fù)血液供應(yīng)后，大腦功能不僅沒(méi)有得到及時(shí)恢復(fù)，反而出現(xiàn)更加嚴(yán)重的功能活動(dòng)障礙[1]。由于腦缺血再灌注后有大量Ca2+內(nèi)流，并生成大量氧自由基，是引起廣泛組織細(xì)胞損傷的主要發(fā)病機(jī)制。目前臨床上公認(rèn)的腦缺血有效治療方法是抗凝、溶栓[2]，但受溶栓時(shí)間窗所限，需要力爭(zhēng)在3～6 h治療時(shí)間窗內(nèi)給予溶栓治療，而在有效時(shí)間窗之外給予溶栓治療其效果并不理想，因此，受溶栓時(shí)間窗所限，缺乏有效的補(bǔ)救時(shí)間是治療腦缺血再灌注損傷的問(wèn)題所在。減輕時(shí)間窗之外的腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，對(duì)提高患者的生活質(zhì)量具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般材料 采用成年美國(guó)癌癥研究所（ICR）雄性小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物提供），體質(zhì)量22～25 g，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，室溫維持在20～25℃。將45只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、大腦中動(dòng)脈阻塞組（MCAO組）和可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（CARTp）處理組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及觀察指標(biāo) 采用線栓法復(fù)制MCAO模型[3]。MCAO組與CARTp處理組小鼠腦缺血2 h后，撤除栓線于不同時(shí)間段進(jìn)行再灌注。Sham組的手術(shù)過(guò)程與MCAO組和CARTp處理組相同，但栓線不插入大腦中動(dòng)脈區(qū)域。CARTp處理組于再灌注開(kāi)始后第2天經(jīng)尾靜脈注射CARTp 2.5μg/kg，以后每天注射CARTp 2.5μg/kg至第10天，Sham組和MCAO組于相同時(shí)間注射等量生理鹽水。給藥后2 h對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，觀察并記錄各組小鼠每天的神經(jīng)功能評(píng)分。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Bederson′sscore評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。兩前肢伸直，無(wú)神經(jīng)病學(xué)征象為0分；一前肢屈曲，另一前肢伸直為1分；運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，身體偏向一側(cè)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)為2分；偏癱，不能站立行走為3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

MCAO組和CARTp處理組神經(jīng)功能評(píng)分均顯著高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CARTp處理組的神經(jīng)功能評(píng)分從第1天至第8天均低于MCAO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從第9天起兩組神經(jīng)功能評(píng)分大致相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與MCAO組比較，bP＜0.05。

時(shí)間第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天Sham組 MCAO組 CARTp處理組0.33±0.11 0.22±0.10 0.22±0.10 0.17±0.09 0.09±0.09 0.09±0.09 0.18±0.12 0.25±0.25 0.25±0.25 0.00±0.00 2.69±0.12a2.44±0.13a2.25±0.14a1.75±0.14a1.63±0.18a1.63±0.18a1.38±0.18a1.25±0.25a1.00±0.00a1.00±0.00a1.33±0.11ab1.24±0.10ab1.05±0.05ab1.05±0.05ab1.07±0.07ab1.07±0.07ab1.00±0.00ab1.00±0.00ab1.00±0.00a1.00±0.00a

3 討 論

腦缺血可引起一系列復(fù)雜的病理生理變化并最終導(dǎo)致腦損傷[5]。腦缺血再灌注可導(dǎo)致大量自由基的存在，造成腦組織損傷和功能障礙；引起鈣通道開(kāi)放，細(xì)胞膜通透性增大，Na+-Ca2+交換異常等導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞、細(xì)胞死亡；腦缺血時(shí)興奮性氨基酸對(duì)缺血腦細(xì)胞具有興奮毒性，是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)；其中缺血半影區(qū)（IP）是介于梗死灶和正常組織之間的移行區(qū)域，是指因缺血致使組織電活動(dòng)停止，但能保持跨膜離子平衡和結(jié)構(gòu)完整的腦區(qū)。而腦缺血再灌注可促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加重IP的炎性反應(yīng)；此外，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因是B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）家族和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，腦缺血再灌注可促進(jìn)Caspase的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。有研究表明，在缺血再灌注之前給予CARTp預(yù)處理可減少腦梗死體積，減少炎癥因子的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用[6]。在腦缺血再灌注損傷后時(shí)間窗之內(nèi)給予CARTp也可以通過(guò)減少腦梗死面積、腦水腫，減輕血-腦脊液屏障的通透性，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)等，從而起到保護(hù)腦組織的作用[7-8]。此外，CARTp還可通過(guò)減輕腦缺血再灌注引起的炎性反應(yīng)起到腦保護(hù)作用[9]，從而減輕神經(jīng)功能障礙。因此，腦缺血再灌注損傷后時(shí)間窗之外的處理對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要意義。

CARTp是一種在體內(nèi)分布廣泛的神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)[10]。其中CART55-102作為CARTp中主要的活動(dòng)片段，在腦中的含量豐富，但不存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)中[11]。CARTp具有廣泛的生理作用，在進(jìn)食與肥胖、精神焦慮行為、體液平衡、免疫功能、新陳代謝、內(nèi)分泌及其他的一些生理過(guò)程中均有作用[12]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，CARTp在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，并且參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，具有一定的中樞保護(hù)作用，是一種很有潛力的神經(jīng)保護(hù)劑[13]。

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP-43）是一種與細(xì)胞及組織整體發(fā)育有關(guān)的蛋白之一，廣泛存在于大腦、小腦、海馬及自主神經(jīng)系統(tǒng)，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞均能表達(dá)GAP-43，作為快速轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的GAP-43起初位于胞體，隨著細(xì)胞突起的延長(zhǎng)而逐漸趨向于突起，最后集中在生長(zhǎng)錐。因此，GAP-43與神經(jīng)再生關(guān)系密切，可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、神經(jīng)再生及突觸重建，從而促進(jìn)神經(jīng)功能重塑[14]。CARTp是否可以促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后小鼠大腦皮層神經(jīng)元GAP-43的表達(dá)及其如何促進(jìn)GAP-43的表達(dá)變化具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究的是腦缺血再灌注損傷后第2天給予CARTp并持續(xù)用藥至第10天的神經(jīng)功能變化。MCAO組與Sham組比較，其神經(jīng)功能評(píng)分高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明腦缺血再灌注后會(huì)引起神經(jīng)功能損傷。從第2天給予CARTp至第8天，CARTp處理組的神經(jīng)功能評(píng)分低于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而第9、10天兩組神經(jīng)功能評(píng)分大致相同，說(shuō)明CARTp可以顯著減輕腦缺血再灌注損傷后急性期的神經(jīng)功能障礙，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，CARTp減輕神經(jīng)功能障礙的作用明顯減弱。有研究證明，腦缺血再灌注可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要形式[15]。CARTp可通過(guò)增加抗凋亡因子減少促凋亡因子的表達(dá)，從而減輕腦缺血再灌注鼠大腦皮層神經(jīng)元的損傷，起到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。大腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪后給予CARTp可增加GAP-43的表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)作用[16]。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的細(xì)胞，它可以通過(guò)釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)損傷神經(jīng)組織的修復(fù)[17]。然而CARTp是否是通過(guò)增加IP星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)從而起到其神經(jīng)保護(hù)作用，以及CARTp如何調(diào)節(jié)IP星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，這些問(wèn)題為下一步研究提供了新的方向。

總之，CARTp可明顯減少腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能評(píng)分，減輕腦缺血再灌注后引起的神經(jīng)功能損傷。表明CARTp可以有效減輕腦缺血再灌注損傷后治療時(shí)間窗之外急性期的神經(jīng)功能障礙。

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Effectof CARTp on neuro-function after cerebral ischem ia-reperfusion

Zhou Yanjun1，Liu Libing1，Zhang Yan2
（1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261053，China；2.Department of Anesthesiology，the Affiliated HospitalofWeifangMedicalUniversity，Weifang，Shandong261031，China）

ObjectiveToexplore theeffectofCocaine-and amphetamine-regulated transcript（CARTp）onmice′sneurofunction after cerebral ischemia-reperfusion atdifferent time periods.MethodsAdultmale Institute of Cancer Research（ICR）ratswere randomly divided into the Sham operation group（the Sham group），themiddle cerebral artery occlusion group（MCAO group）and the CARTp group，15 of each group.The transientmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）ratmodelwas performed by suture-occludedmethod.The 2.5μg/kg CARTp was injected to themice in the CARTp group by vena caudalis on second day after MCAO and then 2.5μg/kg daily till the tenth day while the Sham group and the MCAO group with normal saline. Neurological deficits degree were evaluated by Bederson′s score.Itwas observed and compared the neurological deficits after cerebral ischemia-reperfusion injury to judge theneurologicaldeficitsof the three ratsgroups.ResultsThe neurologicalscoreof theMCAOgroup and the CARTp group was significantly higher than thatof the Sham group，whichwas statistically significant in difference（P＜0.05）.The neurological score of the CARTp group from the first day to the eighth day was lower than thatof the MCAO group.The difference had statisticalsignificance（P＜0.05）..ConclusionCARTpmay relieve the neurological deficitsafter cerebral ischemia-reperfusion，and also playsan important role in recovery ofbrain-neural functions.

Brain ischemia； Reperfusion injury； Cocaine； Amphetamine； Neuropeptides

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.011

：A

：1009-5519（2015）07-0988-03

2014-10-11

2014-11-14）

周彥君（1988-），女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事臨床麻醉工作；E-mail：1196808868@qq.com。

張巖（E-mail：firstxvx3@qq.com）。