不同毒力結核分枝桿菌對THP-1細胞凋亡及細胞因子表達的影響

張 妍，宋紀偉，曾范利，時 坤，李健明，劉 楊，劉 菲，孫凡婷，杜 銳，4*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林市人民醫院，吉林 132001；3.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；4.教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

不同毒力結核分枝桿菌對THP-1細胞凋亡及細胞因子表達的影響

張 妍1，宋紀偉2，曾范利3，時 坤3，李健明3，劉 楊1，劉 菲1，孫凡婷1，杜 銳3，4*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林市人民醫院，吉林 132001；3.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；4.教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

為探討不同毒力結核分枝桿菌(MTB)感染巨噬細胞后不同時間點細胞凋亡情況與其分泌的幾種主要細胞因子轉錄與表達之間的關系，建立THP-1體外巨噬細胞模型，用不同毒力MTB(強毒株H37Rv、弱毒株BCG)感染細胞，應用流式細胞術檢測巨噬細胞在六個時間點的凋亡情況，應用熒光定量PCR檢測細胞因子TNF-α、IL-10、IL-6的轉錄水平，應用ELISA方法檢測細胞上清液中三種細胞因子的分泌量。結果顯示：BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)。巨噬細胞細胞因子TNF-α、IL-6的轉錄水平與分泌水平相符，弱毒菌株巨噬細胞凋亡情況隨時間延長成上升趨勢，其分泌的細胞因子TNF-α表現為相同趨勢，IL-6表現為相反趨勢。強毒株巨噬細胞凋亡情況低于弱毒株，細胞因子分泌情況復雜，一般表現為一種先增強后抑制的情況。本試驗通過對不同時間點細胞因子與凋亡情況關系的研究為結核分枝桿菌對巨噬細胞凋亡機制提供新思路。

不同毒力結核分枝桿菌；THP-1細胞；凋亡；細胞因子

結核病(Tuberculosis，TB)是一種慢性消耗性人畜共患傳染病。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后通常表現為慢性癥狀，并且感染后的潛伏期較長，潛伏期的動物具有傳染性[1]。病畜尤其是具有開放性結核的病畜是人類結核病的主要傳染源[2]。由于結核分枝桿菌是典型的胞內寄生菌，主要在宿主巨噬細胞等免疫系統內存活和繁殖，并已證實巨噬細胞在結核分枝桿菌免疫逃逸情況中占有重要作用[3]。在小鼠模型中也證實，除了巨噬細胞外，位于肺實質內的一些不成熟的單核細胞可以在其分化為巨噬細胞前進入感染部位并被感染[4]。不同毒力的結核分枝桿菌引起巨噬細胞凋亡水平不同，其逃逸機制與多種因素相關，其中細胞因子對巨噬細胞凋亡有重要的調控作用。TNF-α一般認為可由巨噬細胞內源性分泌，具有促進細胞凋亡的作用[5]。有報道稱，結核分枝桿菌可以強化細胞內的一種生存蛋白(EIS)，通過JNK依賴性產生RIO從而抑制TNF-α的產生，防止巨噬細胞活化、炎癥和自體吞噬等反應[6-8]。IL-10被認為是細胞因子合成的抑制因子，能夠抑制多種促炎性細胞因子的分泌[9]。人醫認為IL-10的水平與結核分枝桿菌的存活成正相關[10]。在動物中也有IL-10能夠誘導結核分枝桿菌再活化的報道[11]。IL-6在新近的報道中證明可以抑制由結核分枝桿菌感染引起的巨噬細胞自噬。IL-6的分泌增加有利于結核分枝桿菌抑制機體先天性免疫應答[12]。本研究通過對不同毒力結核分枝桿菌感染細胞后細胞凋亡情況和其分泌的三種主要細胞因子的分析，對結核分枝桿菌引起的細胞凋亡及抑制細胞凋亡的機制進行深層探討。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細胞購自中國科學院上海細胞庫；強毒結核分枝桿菌H37Rv由吉林大學孫長江老師贈予；弱毒結核分枝桿菌BCG由本實驗室保存；EDTA(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；β-巰基乙醇(Amresco公司)；1640培養基(Hyclone公司)；二甲基亞砜(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；佛波酯phorbol 12-myristste13-acetate，PMA(Sigma公司)；FITC Annexin V-PI調亡檢測試劑盒(美國BD公司)；細胞因子酶聯免疫試劑盒(RD分裝)；DEPC(Amresco公司)； TRIzol(大連寶生物公司)；SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(大連寶生物公司)；Primescript?RT reagent Kit With gDNA Erase(大連寶生物公司)；其他常規化學試劑均為分析純試劑。

1.2 THP-1細胞培養

THP-1人單核細胞為懸浮細胞，正常情況下為亮圓形，采用含10%血清、1%雙抗的1640細胞培養液于含50 mL·L-1CO2的37 ℃的細胞培養箱中培養。換液時需要1 000 r·min-1離心5 min，計數調整其濃度為5×105·mL-1，用100 ng·mL-1的PMA誘導24 h使懸浮細胞貼壁，于12孔板中繼續培養。

1.3 結核分枝桿菌培養

實驗室羅氏培養基上保存的結核分枝桿菌成簇生長為乳黃色塊狀物，卡介苗表面成菜花樣，結核分枝桿菌表面光滑，將其刮下接種于7H9液體培養基培養3～5 d，可見液體渾濁，內有白色顆粒，有菌膜掛壁。將菌液進行倍比稀釋涂板進行菌落計數，離心用PBS稀釋使其終濃度為5×106·mL-1，備用。

1.4 結核分枝桿菌感染巨噬細胞模型建立

結核分枝桿菌感染12孔板中生長12 h以上貼壁良好的THP-1細胞，于CO2的37 ℃細胞培養箱中孵育4 h(此時使用的營養液不含血清不含雙抗)。吸出營養液重新加入含血清不含雙抗的營養液繼續培養1、2、4、12、24、48 h。

1.5 THP-1細胞凋亡檢測

用不含EDTA的胰酶對細胞進行消化，用含血清不含雙抗的1640終止消化，用1 mL冷PBS懸浮細胞，洗滌細胞兩次并計數使其終細胞數為1×105個，加入100 μL Buffer，3 μL FITC，3 μL PI染料，避光25 °C孵育15 min，最后加入200 μL Buffer。在1 h內進行流式檢測。

1.6 細胞因子轉錄水平檢測

提取RNA并進行反轉錄，按說明書進行操作。熒光定量PCR，反應體系：SYBR?Premix ExTaqII 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL(表1)，模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，反應條件： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，不同退火溫度(60～64 ℃)30 s，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環；采集熒光信號得出擴增產物的解鏈曲線。

表1 熒光定量PCR引物及退火溫度

Table 1 Quantitative PCR primers and annealing temperature

引物名稱Primername序列(5′?3′)Sequence最適退火溫度/℃AnnealingtemperatureIL?6?FIL?6?RGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTCAGCAGGCTGGCATTTG62IL?10?FIL?10?RGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGAAAGGCTTGGCAACCCAGGTA64TNF?α?FTNF?α?RTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCAGAGGGCTGATTAGAGAGAGGT60β?actin?Fβ?actin?RGGACTTCGAGCAGGAGATGGTGAAGGTGGTCTCGTGGATG62

1.7 細胞因子ELISA檢測

收集細胞上清液及給定標準品按ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀在450 nm處測得OD值。

2 結 果

2.1 不同時間點細胞凋亡

流式細胞術FITC/PI雙染試劑盒結果FITC陽性，PI陰性表示細胞早期凋亡；FITC和PI均陽性表示細胞晚期凋亡或有損傷的死細胞。BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均高于對照組，并且其差異具有統計學意義(P<0.05)，其中BCG組的早期凋亡率隨時間的延長在逐步增加，H37Rv組的早期凋亡率在4 h時較低，在12 h后趨于穩定(圖1)。值得注意的是通過分析其晚期凋亡和死細胞結果發現，在感染24 h后，強毒標準菌H37Rv組的凋亡率大幅下降，甚至低于對照組(圖2)。

圖1 結核分枝桿菌感染THP-1細胞6個時間點早期凋亡情況Fig.1 Early apoptosis of Mycobacterium tuberculosis infection in THP-1 cells at six time points

圖2 THP-1細胞未感染組和H37Rv感染組5個時間點流式結果Fig.2 Streaming chart of THP-1 cells of uninfected group and H37Rv infection group at five time points

2.2 不同時間點細胞因子轉錄水平

對熒光定量PCR 結果用2-ΔΔCt法進行分析。通過引入管家基因，消除由于收集細胞、反轉錄及加樣過程中產生的操作誤差。用0 h 表示未經感染的對照組細胞，其表達量為1。與對照組相比各時間點差異均顯著(P<0.05)，結果有統計學意義。

對于TNF-α轉錄水平，H37Rv組整體低于BCG組，在12 h達到最大值。BCG組的轉錄水平在4、12、24 h時高出對照組十倍以上(圖3)。

對于IL-6轉錄水平，H37Rv組整體高于BCG組，在12 h達到最大值并高出對照組18.2倍。BCG組在4 h達到最大值，在1、12、24、48 h其轉錄水平低于對照組(圖3)。

對于IL-10，相比對照組，其轉錄水平變化不大，H37Rv組在各時間點轉錄水平均高于對照組，而BCG組只有在2、4 h時其轉錄水平高于對照組(圖3)。

2.3 不同時間點細胞因子表達結果

根據標準品濃度和OD值應用ELISAcalc軟件計算標準曲線回歸方程，代入測定的結果得出TNF-α、IL-10、IL-6在不同時間點上清液中分泌的細胞因子濃度。

對于TNF-α，其H37Rv組和BCG組的分泌量均顯著高于對照組(P<0.05)。BCG組呈上升趨勢，H37Rv組在12 h分泌量最低。

對于IL-6，其H37Rv組和BCG組的分泌量均極顯著高于對照組(P<0.01)。H37Rv組在12 h達到最大值116.2 ng·L-1，BCG組在2 h后分泌量開始下降，但總體變化不大。

對于IL-10其H37Rv組和BCG組的分泌量均顯著高于對照組(P<0.05)。BCG組在4 h達到最大值116.5 ng·L-1，H37Rv組呈波動變化，兩者差異不顯著(圖3)。

3 討 論

在結核分枝桿菌與巨噬細胞的相互作用過程中，巨噬細胞在行使免疫細胞功能殺滅結核分枝桿菌的同時，結核分枝桿菌也同時在逃逸巨噬細胞的免疫，這就造成了結核的慢性癥狀，使其具有潛伏性和傳染性，給診斷和治療帶來了巨大困難[13-14]。研究發現，不同毒力的結核分枝桿菌感染巨噬細胞后，誘導巨噬細胞凋亡水平不同[15]。M.K.Balcewicz-Sablinska等分別用結核分枝桿菌強毒標準株H37Rv株和結核分枝桿菌減毒株H37Ra株感染肺泡巨噬細胞，結果顯示，對比與對照組巨噬細胞的凋亡率均有顯著增高，相比于弱毒組H37Rv組的凋亡情況明顯受到抑制[16]。本研究采用FITC/PI雙染試劑盒可以準確定量出不同時間點發生早期凋亡和晚期凋亡壞死的細胞。BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均高于對照組，并且其差異具有統計學意義(P<0.05)。通過掌握不同毒力的結核分枝桿菌感染巨噬細胞的動態凋亡情況，分析巨噬細胞分泌的三種主要細胞因子對細胞凋亡產生的作用。

圖3 結核分枝桿菌感染巨噬細胞6個時間點細胞因子變化情況Fig.3 Cytokine changes at six time points of Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages

通過對熒光定量和ELISA結果分析得出BCG組TNF-α的轉錄水平與其逐步升高的分泌量關系相符，IL-6轉錄水平在12 h后被抑制與其4 h后逐步下降的分泌量關系相符，IL-10的分泌量有波動并不與其轉錄水平相符，分析可能還受其他因素影響。在48 h內，BCG誘導的巨噬細胞凋亡情況與TNF-α分泌量呈正相關，與IL-6的分泌量呈負相關。H37Rv組TNF-α的轉錄水平低于BCG組并在4、12 h時高于對照組，在24 h后被抑制。其分泌量在2 h時遠高于BCG組，后逐步降低，分析在感染初期結核分枝桿菌強毒株比弱毒株更能刺激TNF-α分泌，但于感染后24 h被抑制。IL-6在12 h前的轉錄水平與其逐步升高的分泌量關系相符，24 h后轉錄水平和分泌量均下降。對比與對照組分析，可能是IL-6的分泌主要集中在前24 h，后期分泌量自然下降。IL-10的轉錄情況較復雜，其分泌量在4 h最高而后下降并與BCG組呈相反的趨勢。在12 h后強毒株H37Rv誘導的巨噬細胞早期凋亡情況已經趨于穩定，而晚期凋亡和壞死的細胞在減少，這與12～24 h時間段內細胞因子的變化情況相符。分析此時間段是結核分枝桿菌發揮逃逸作用的關鍵時期。本研究通過對不同毒力結核分枝桿菌感染巨噬細胞后凋亡情況監控和其三種主要細胞因子的轉錄水平和分泌水平的分析，將對不同毒力結核分枝桿菌引起及抑制細胞凋亡的機制有更深層的理解。

4 結 論

BCG和H37Rv感染THP-1細胞的早期凋亡率均高于對照組，并且H37Rv組有抑制趨勢。這與細胞因子TNF-α、IL-6的轉錄水平和分泌水平有一定相關性。通過對巨噬細胞凋亡機制的研究將有助于闡明結核病的發病機制，為結核病的防治提供新的思路。

[1] YOUNG B D，PERKINS M D，DUNCAN K，et al.Confronting the scientific obstacles to global control of tuberculosis[J].JClinInvest，2008，118(4)：1255-1265.

[2] ZANELLA G，BAR-HEN A，BOSCHIROLI M L，et al.Modelling transmission of bovine tuberculosis in red deer and wild boar in Normandy，France[J].ZoonosesPublicHealth，2012，59(Suppl 2)：170-178.

[3] NIEMANN S，RICHTER E，RüSCH-GERDES S.Biochemical and genetic evidence for the transfer ofMycobacteriumtuberculosissubsp.caprae Aranaz et al.1999 to the speciesMycobacteriumbovisKarlson and Lessel 1970(approved lists 1980) asMycobacteriumbovissubsp.caprae comb.nov[J].IntJSystEvolMicrobiol，2002，52(Pt2)：433-436.

[4] DANNENBERG A M Jr.Perspectives on clinical and preclinical testing of new tuberculosis vaccines[J].ClinMicrobiolRev，2010，23(4)：781-794.

[5] HARRIS J，HOPE J C，KEANE J.Tumor necrosis factor blockers influence macrophage responses toMycobacteriumtuberculosis[J].JInfectDis，2008，198(12)：1842-1850.

[6] WEI J，DAHL J L，MOULDER J W，et al.Identification of aMycobacteriumtuberculosisgene that enhances mycobacterial survival in macrophages[J].JBacteriol，2000，182(2)：377-384.

[7] SHIN D M，JEON B Y，LEE H M，et al.Mycobacteriumtuberculosiseis regulates autophagy，inflammation，and cell death through redox-dependent signaling[J].PLoSPathog，2010，6(12)：e1001230.

[8] KIM K H，AN D R，SONG J，et al.MycobacteriumtuberculosisEis protein initiates suppression of host immune responses by acetylation of DUSP16/MKP-7[J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(20)：7729-7734.

[9] ZHU J，GUO L，MIN B，et al.Growth factor independent-1 induced by IL-4 regulates Th2 cell proliferation[J].Immunity，2002，16(5)：733-744.

[10] COOPER A M.Cell-mediated immune responses in tuberculosis[J].AnnuRevImmunol，2009，27：393-422.

[11] 楊穎喬，彭圣威.肺結核患者細胞因子水平測定的臨床研究[J].咸寧學院學報(醫學版)，2009，23(3)：211-212. YANG Y Q，PENG S W.Clinical research of cytokine levels on tuberculosis patients[J].JournalofXianningUniversity(Medicalsciences)，2009，23(3)：211-212.(in Chinese)

[12] DUTTA R K，KATHANIA M，RAJE M，et al.IL-6 inhibits IFN-γ induced autophagy inMycobacteriumtuberculosisH37Rv infected macrophages[J].IntJBiochemCellBiol，2012，44(6)：942-954.

[13] 卜文甲．家畜結核分枝桿菌致病性的分析[J].養殖技術顧問，2012(11)：148. BU W J.Analysis of the pathogenic on livestockMycobacteriumtuberculosis[J].TechnicalAdvisorforAnimalHusbandry，2012(11)：148.(in Chinese)

[14] GRIFFIN J F，RODGERS C R，LIGGETT S，et al．Tuberculosis in ruminants：characteristics of intra-tonsilarMycobacteriumbovisinfection models in cattle and deer[J]．Tuberculosis(Edinb)，2006，86(6)：404-418.

[15] JANSEN F H，ROOBOL M，JENSTER G，et al．Screening for prostate cancer in 2008 II：the importance of molecular subforms of prostate-specific antigen and tissue kallikreins[J].EurUrol，2009，55(3)：563-574．

[16] BALCEWICZ-SABLINSKA M K，KEANE J，KORNFELD H，et al.PathogenicMycobacteriumtuberculosisevades apoptosis of host macrophages by release of TNF-R2，resulting in inactivation of TNF-α[J].JImmunol，1998，161(5)：2636-2641.

(編輯 白永平)

Effect of Different VirulenceMycobacteriumtuberculosison Cytokine Expression and Apoptosis of THP-1 Cells

ZHANG Yan1，SONG Ji-wei2，ZENG Fan-li3，SHI Kun3，LI Jian-ming3，LIU Yang1， LIU Fei1，SUN Fan-ting1，DU Rui3，4*

(1CollegeofAnimalScience&Technology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China； 2.JilinPeople′sHospital，Jilin132001，China；3.CollegeofChineseMedicineMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；4.KeyLaboratoryofAnimalProduction，ProductQualityandSecurityofMinistryofEducationofthePeople′sRepublicofChina，LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince，Changchun130118，China)

In order to investigate the relationship between apoptosis and transcription and expression of several major cytokines duringMycobacteriumtuberculosis(MTB)infection，THP-1 derived macrophage was selected to establishinvitromodel.Infected cells with different virulence MTB (H37Rv，BCG)，flow cytometry was used to detect macrophage apoptosis at six time points，quantitative PCR was used to detect transcription level of cytokines TNF-α，IL-10，IL-6，ELISA was used to detect the secretion of cell supernatants of three cytokines.The results showed：the early apoptotic rate of BCG and H37Rv group were both higher than control group and the difference was statistically significant (P<0.05).Transcription levels of cytokines，TNF-α，IL-6 were consistent with the level of secretion.There was an increase with time on apoptosis of low virulent strain，and there is a same trend on secretion of TNF-α，an opposite tendency on secretion of IL-6.Apoptosis of virulent strains was less than attenuated vaccine strain.Secretion of virulent strains was complex，like increase first and then suppression.The relationship between cytokines and apoptosis of cells at different time points may provide new ideas for study of macrophage apoptosis mechanisms.

Mycobacteriumtuberculosis；THP-1 cells；apoptosis；cytokine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.015

2014-12-23

國家自然科學基金(31372436)；吉林省科技廳科技成果轉化促進計劃(20140309018YY)；吉林省科技廳科技成果轉化促進計劃(20140412009XH)；吉林省科技廳科技創新人才培育計劃(20130521023JH)

張 妍(1989-)，女，遼寧大連人，碩士生，主要從事經濟動物疫病研究，E-mail：811285453@qq.com

*通信作者：杜 銳，教授，博導，主要從事經濟動物疫病研究，E-mail：durui71@126.com，Tel：0431-84510946

S852.618

A

0366-6964(2015)09-1600-06