平糖舒目散治療糖尿病的作用機制初探

司進輝 任 曉 張彥廷

(1 河北華健天誠科技開發(fā)有限公司，石家莊，050026； 2 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，石家莊，050015)

平糖舒目散治療糖尿病的作用機制初探

司進輝1任 曉2張彥廷2

(1 河北華健天誠科技開發(fā)有限公司，石家莊，050026； 2 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，石家莊，050015)

目的：通過醛糖還原酶高通量模型對中藥方劑平糖舒目散的篩選，探尋其治療糖尿病的作用機制。方法：用高通量醛糖還原酶篩模型來篩選平糖舒目散，研究方劑平糖舒目散對醛糖還原酶的抑制作用。結果：平糖舒目散對醛糖還原酶有較強的抑制作用,其半數(shù)抑制濃度是0.8 g/L。結論：中藥方劑平糖舒目散治療糖尿病慢性并發(fā)癥的作用機制之一是抑制醛糖還原酶活性。

糖尿病/并發(fā)癥；醛糖還原酶；高通量篩選；平糖舒目散

國際糖尿病聯(lián)合會的數(shù)據(jù)顯示，目前，全球糖尿病患者接近2.5億人，到2025年將達3億[1]。糖尿病發(fā)展到中期以后，眼睛、外周神經、腎臟等多種易損器官內發(fā)生的微血管病變，都與人體在長期高血糖狀況下，葡萄糖代謝分支路徑被激活，醛糖還原酶活性異常升高關聯(lián)密切。醛糖還原酶就成了延緩和防治糖尿病并發(fā)癥的關鍵因素[2]。

張運華主任醫(yī)師從醫(yī)40余載，熟諳岐黃，以平糖舒目散加減(“治療糖尿病慢性視網膜病變的中藥制劑及制備方法”，專利號：第270124號)治療糖尿病，對防治糖尿病性視網膜病變及其他慢性并發(fā)癥的如神經病變等也有很好的治療作用。平糖舒目散是用該專利核心方藥物配伍制得的純中藥散劑，在臨床上治療糖尿病慢性并發(fā)癥，屢有效驗。為探尋平糖舒目散的作用機制，我們在國家科技部新藥篩選技術平臺重大專項(編號：2002AA2AZ343D)、國家“十五”重大攻關項目(編號：2004AA2Z38784)資助支持下，建立的糖尿病及其并發(fā)癥評價體系中的高通量藥物篩選(HTS)模型之糖尿病藥物篩選模型上做了平糖舒目散抑制醛糖還原酶活性的測試研究，現(xiàn)做如下報道。

1 材料

1.1 平糖舒目散藥物組成 密蒙花9 g，天花粉10 g，桑葉9 g，菊花(杭白菊)8 g，山茱萸(去核生用)6 g，紅花5 g，木賊3 g，以上7味，混勻粉碎，收集藥粉，包裝。規(guī)格：6 g/包。2次/d，1包/次，口服。以上藥物均由河北贊皇張運華名老中醫(yī)診所提供，經過河北省食品藥品檢定院中藥室趙曉春主任藥師鑒定為正品。

1.2 主要試劑 醛糖還原酶(從非電擊致死豬眼睛的晶狀體中，實驗參與人員自己提取，經硫酸銨分級沉淀處理得到)；輔酶NADPH(南京奧多福尼生物科技有限公司)；硫酸鋰(南京化學試劑有限公司)；甘油醛(德國Sigma公司)。槲皮素(河北省食品藥品檢定院)。

1.3 主要儀器 SHB-Ш T循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DZF-6093型真空干燥箱(天津天有利科技有限公司)；TGL-20M型臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；LABOROTA-4000型旋轉蒸發(fā)器(德國HeidLph公司)；Christ牌ALPHAI-CD冷凍干燥機(德國 marin Christ公司)；SZ-1快速混勻器(上海上登實驗設備有限公司)；Victor21420多功能測定儀(美國PF公司)。

2 方法

2.1 平糖舒目散篩選用的樣品制備

2.1.1 預試驗樣品制備 平糖舒目散按成人日用藥量的1/5倍來備料配藥，按平糖舒目散藥量的22倍加60%乙醇，分3次提取，提取時間分別2 h，1.5 h，45 min，過濾合并3次提取的藥液，濃縮至密度1.12，加入20 mL純凈水振蕩搖勻后，依次分別加入20 mL乙酸乙酯、正丁醇萃取，將平糖舒目散分離成3種：乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，各吸取2 mL蒸干稱量后，都用二甲基亞砜為溶劑，溶解成溶液，按濃度梯度依次稀釋成1/3倍、1/9倍、1/27倍、1/81倍、1/243倍、1/729倍的藥液，分別吸取2.5 μL平行樣3個、7.5 μL平行樣3個，制得預實驗篩選用樣品108個。

2.1.2 量效關系、與陽性對照藥對比研究的試驗樣品制備 用純凈水作溶媒提取，藥液濃縮至稠膏后，依次用90%，60%，30%，50%的濃度梯度的乙醇精制過濾，4種藥液加剩下的沉淀物，離心冷凍蒸干后，得到平糖舒目散組分1、組分2、組分3、組分4、組分5共5種組分，精密稱量后，加二甲基亞砜溶解，分別吸取2.5 μL平行樣3個、7.5 μL平行樣3個。共有360個樣品供篩選。

2.2 醛糖還原酶活性測定原理及醛糖還原酶抑制劑活性測定方法 在NADPH的參與下，醛糖還原酶將DL-甘油醛催化還原成甘油，與此對應NADPH在同一時間被轉化為NADP+，而剩余的還原態(tài)NADPH在340 nm處仍有特征吸收[3]，醛糖還原酶活性的測定就這樣，通過測定340 nm處光密度的下降速率的變化值來間接地得以實現(xiàn)。采集非電擊致死1 h內的豬眼睛，冰塊保存帶回實驗室，入冰柜保存。篩選用醛糖還原酶，臨時從采挖的豬眼睛晶狀體中提取。反應在多孔板中進行，樣品孔中加入NaPi緩沖液(濃度：50 mmol/L,酸堿度：pH 6.4)、適量的酶液和樣品液,共46 μL；對照孔以水代替樣品溶液;空白孔以水代替樣品液并以NaPi緩沖液代替酶液,在36.5 ℃保溫12 min[3]。各孔加入34 μL的Li2SO4(濃度：1.0 mol/L)，6.5 μL的DL-甘油醛(濃度：40 mmol/L)和5.5 μL的NADPH(濃度：1.8 mmol/L)，開始化學還原反應。每min被檢測物吸收掉的光密度值的減少量ΔA，是用Victor21420多功能測定儀測定340 nm處被檢測物吸收掉的光密度數(shù)值變化獲得。

抑制率=[(ΔA對照-ΔA樣品)/(ΔA對照-ΔA空白)]×100%。

3 結果

3.1 預實驗平糖舒目散樣品研究結果 預實驗平糖舒目散分離得到的3個不同相，分別制備48個樣品，確定各自的濃度后，在高通量藥物篩選模型上進行篩選，參照篩選化學藥物數(shù)據(jù)的處理和分析方法作初步的評價，結果：乙酸乙酯相組分、正丁醇相組分對醛糖還原酶有抑制作用較強。(表1)

3.2 平糖舒目散提取物抑制醛糖還原酶(AR)的量效關系研究結果(表2) 表2中的平糖舒目散提取物，是本文中“2.1.1量效關系、與陽性對照藥對比研究的試驗樣品制備”法得到的平糖舒目散組分3。結果顯示平糖舒目散對醛糖還原酶的半數(shù)抑制濃度是0.8 g/L。

表1 預實驗平糖舒目散樣品研究結果

表2 平糖舒目散提取物抑制醛糖還原酶

3.3 與陽性對照藥的對比研究結果 單一化合物槲皮素能抑制醛糖還原酶的活性，多數(shù)研究者選擇其為陽性對照[4]。用水提取得到的平糖舒目散藥液濃縮物中用60%濃度梯度的乙醇精制處理得到的平糖舒目散組分3與陽性對照藥槲皮素統(tǒng)一用甲基亞砜做溶劑，配成濃度1 g/L、2.0 g/L的溶液，共4個樣品。(表3)

表3 與陽性對照藥的對比研究結果

4 討論

中藥成分復雜，即使只有一味藥，常常也是多類成分并存，也可看做是一個小復方[5]，方劑學常說“單藥不成方”。方劑是運用藥物治病的進一步發(fā)展和提高[6]。

罹患糖尿病時，在長期高血糖狀態(tài)下，醛糖還原酶活性會異常性增高，來代償性分解人體血液中多余的葡萄糖，多元醇通路就被激活，此代償性的分解路線的最終產物之一是山梨醇，它極性大，不易被人體組織細胞轉運出去，久而久之導致山梨醇在人體組織晶狀體、神經、腎臟、視網膜等糖尿病人體易損器官細胞內堆積，使易損器官細胞的代謝與功能受到損害，是導致糖尿病慢性并發(fā)癥的重要原因之一[7]，抑制醛糖還原酶就有可能有效延緩防止糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。中醫(yī)能治療消渴癥(糖尿病)藥物，在分子、細胞水平上必然表現(xiàn)出某種作用[8]。張運華等人認為，治療糖尿病不能拘泥于消渴病“陰虛燥熱”這一病機，一味使用陰柔滋補之品養(yǎng)陰清熱。糖尿病及其伴隨的慢性并發(fā)癥更多的是火郁于內，主要郁滯在脾胃腸，是以邪實為主。在臨床治療上采用清、下二法。據(jù)此，張運華等人以平肝清熱，活血養(yǎng)肝為治療大法發(fā)明了平糖舒目散治療糖尿病。

現(xiàn)代藥理藥化研究[9]中已證實，密蒙花中的黃酮類物質(密蒙花苷等)、苯乙醇苷類物質(洋丁香苷等)和皂苷類成分均顯示出醛糖還原酶抑制作用，桑葉可通過增加胰島素的釋放和抑制α-糖苷酶的活性，抑制血糖上升，可防治和治療糖尿病[10]。天花粉具有胰島素樣作用，有五種降血糖有效成分[11]。平糖舒目散對糖尿病小鼠具有顯著的降糖作用，并能一定程度改善“三多”現(xiàn)象[12]。

高通量藥物篩選方法實現(xiàn)了藥物篩選的快速、微量[13]。本文借助高通量藥物篩選模型，嘗試由微觀角度來研究平糖舒目散，尋找平糖舒目散的作用靶點，探尋從反向藥理學來闡明平糖舒目散發(fā)揮療效的化學物質基礎。本次篩選結果顯示：對醛糖還原酶抑制作用平糖舒目散能呈較好的量效關系，其對醛糖還原酶的半數(shù)抑制濃度是0.8 g/L，從具體分子和細胞功能變化上看，平糖舒目散發(fā)揮臨床療效的作用機制可能與其抑制醛糖還原酶有關。

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(2014-12-18收稿 責任編輯：洪志強)

Exploration on Mechanism of Pingtang Shumu Powder in Treating Diabetes

Si Jinhui1, Ren Xiao2, Zhang Yanting2

(1HebeiHuajianTianchengPharmaceuticalTechnologyCo.,Shijiazhuang050026,China; 2HuabeiMedicalGroupNewDrugResearchandDevelopmentCo.,Shijiazhuang050015,China)

Objective:To explore the mechanism of Chinese prescription Pingtang Shumu powder in treating diabetes by screening it in high-flux aldose reductase models.Methods:High-flux aldose reductase model was used to screen Pingtang Shumu powder, so as to study on its exhibition effect on aldose reductase.Results:Pingtang Shumu powder had strong exhibition effect on aldose reductase with the Icso of 0.8g/L.Conclusion:The mechanism of Chinese prescription of Pingtang Shumu powder treating chronic complications of diabetes is to exhibit the activity of aldose reductase.

Diabetes; Complications; Aldose reductase; Hign-flux screening; Pingtang Shumu powder

河北省科技攻關計劃課題(編號：07276101D-7)

R285.5;R255.4

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.027