改良PAS染色法在急性肝損傷中的應用

張 風 陶艷艷,2 陳高峰,2

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝病研究所，上海，201203; 2 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203)

改良PAS染色法在急性肝損傷中的應用

張 風1陶艷艷1,2陳高峰1,2

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝病研究所，上海，201203; 2 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203)

目的：觀察改良肝臟糖原PAS染色法，并觀察肝臟糖原染色在急性肝損傷中的應用。方法：復制CCl4急性肝損傷模型，首次100% CCl43 mL/kg皮下注射，此后50% CCl4橄欖油溶液2 mL/kg每周2次共4次皮下注射，誘導大鼠急性肝損傷模型。計算大鼠肝體比；HE染色觀察肝組織炎癥病理；試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBil)、白蛋白(Alb)。肝臟常規PAS染色與改良PAS染色觀察肝糖原染色。結果：與正常組相比，模型組ALT、AST活性與TBil含量明顯升高(P<0.05)，Alb含量明顯降低(P<0.05)；HE染色示，模型組肝小葉結構排列紊亂，肝細胞脂肪變、氣球樣變明顯。常規PAS染色，正常組肝組織PAS染色陽性占肝臟面積為32.38%±5.50%；與正常組相比，模型組肝組織PAS陽性染色明顯減少(P<0.01)，占肝臟面積為8.60%±3.34%。改良PAS染色提示，正常組肝臟可見大量PAS陽性染色，占肝臟面積為75.50%±9.02%；與正常組相比，模型組肝組織PAS陽性染色明顯減少(P<0.01)，占肝臟面積為17.61%±3.53%。在空白對照組與模型肝組織中，肝糖原改良PAS染色陽性率明顯高于常規PAS染色法(P<0.01)。改良PAS染色肝糖原陽性染色面積更真實反映急性肝損傷程度。結論：改良肝臟糖原PAS染色法有助于急性肝損傷程度評估。

肝糖原；急性肝損傷；PAS染色法；改良

肝臟是機體代謝的主要器官，對糖的存儲、分布和調節起重要作用。血中葡萄糖可自由通過肝細胞，口服葡萄糖后約60%被攝取，進人肝細胞后經葡萄糖激酶迅速被磷酸化為6-磷酸-葡萄糖(G-6-P)，并進一步經糖原合成酶合成為糖原貯存[1]。在肝臟，當機體需要時，便可分解成葡萄糖，轉化為能量；當肝細胞發生彌漫性嚴重損害時，肝糖原合成障礙及貯存減少，主要表現為磷酸戊糖途徑及糖醇解途徑相對增強；糖有氧氧化及三羧酸循環運轉不佳，肝中葡萄糖-6-磷酸酶活性增加，使肝糖原迅速分解為6-磷酸-葡萄糖，并在限速酶糖原磷酸化酶催化下，生成葡萄糖補充血糖，導致肝糖原含量明顯下降。在評價肝損傷程度時，肝糖原為常規檢測項目，糖原的含量能說明肝損傷程度[2]。肝臟糖原測定有蒽酮法[3]、氧化酶法[4]、PAS染色法[5]，近期我們采用糖原染液試劑，改良肝組織固定方法，成功原位檢測肝組織糖原表達位置與水平，用于急性肝損傷的評估。

1 材料

1.1 動物 Wistar大鼠20只，雄性，SPF級，體重160～170 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，設施許可證號：SYXK(滬)2009-0069，所有動物均自由飲食。

1.2 主要試劑 四氯化碳(Carbon Tetrachloride，CCl4)，化學純，批號20140325；橄欖油，化學純，批號F20110402，均購自國藥集團；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBil)、白蛋白(Alb)購自上海科華生物。肝糖原過碘酸希夫染色(Periodic Acid-schiff，PAS染色)試劑盒糖原染液試劑盒(批號20140925)，購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型制備 CCl4急性肝損傷模型參照經典造模法[6-9]并改進。本實驗染毒5次，即第1、4、7、10、13天上午9點各1次。首次皮下注射100% CCl43 mL/kg大鼠體重，此后50% CCl4橄欖油溶液2 mL/kg大鼠體重。正常組大鼠皮下注射相同容積的橄欖油溶液。

2.2 分組 Wistar大鼠20只，按照完全隨機分組的原則，分為正常組8只，模型組12只。

2.3 肝系數與血清肝功能 實驗第14天晚禁食，第15天早晨9點殺鼠。肝系數：殺鼠時稱量體重、肝重，計算肝重(g)占體重(g)的百分比。腹主動脈取血，分離血清，測定：1)丙氨酸氨基轉移酶(ALT)；2)天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)；3)總膽紅素(TBil)；4)白蛋白(Alb)，檢測方法均參照試劑盒說明書。

2.4 肝組織病理學觀察 實驗第15天殺檢時肉眼大體觀察記錄，取肝右葉相同部位組織常規10%用中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，作HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理病變。同時取肝右葉相同部位組織制作冰凍切片和Carnoy液固定，用于肝糖原染色。根據CCl4急性肝損傷模型的肝組織病理病變特點，參考非乙醇性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[10]，常規進行肝細胞脂肪變與氣球樣變積分：1)肝細胞脂肪變：0分(<5%);1分(5%～33%);2分(34%～66%)；3分(>66%)。2)肝細胞氣球樣變：0分，無;1分，少見;2分，多見。

2.5 肝糖原染色 試劑盒常規肝糖原過碘酸希夫(Periodic acid-schiff，PAS)染色：試劑A：主要由1%過碘酸組成。試劑B：主要由堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、活性碳等組成。試劑C：主要由蘇木素、乙醇、甘油等組成。乙醇-醋酸-氯仿固定液(卡諾固定液，Carnoy fixative)配方：純乙醇3份+冰醋酸1份。常規PAS操作步驟：1)肝組織Carnoy液固定，常規脫水包埋；2)石蠟切片脫蠟入蒸餾水；3)自來水沖洗2～3 min，再用蒸餾水浸洗2次；4)置于試劑A中，室溫放置5～8 min，一般不宜超過10 min；5)自來水沖洗1次，再用蒸餾水浸洗2次；6)樣本放入試劑B，置于室溫陰暗處，浸染10～20 min；7)自來水沖洗10 min；8)樣本置于試劑C中，染核1～2 min；9)自來水沖洗10～15 min后，更換雙蒸水清洗，使其返藍；10)逐級常規乙醇脫水；11)二甲苯透明；12)中性樹膠封固。

改良肝糖原染色：1)肝組織冰凍切片(8 μm)；2)置于試劑A中，室溫放置5～8 min(一般不宜超過10 min)；3)自來水沖洗1次，再用蒸餾水浸洗2次；4)樣本放入試劑B，置于室溫陰暗處，浸染10～20 min；5)自來水沖洗10 min；6)樣本置于試劑C中，染核1～2 min；7)自來水沖洗10～15 min后，更換雙蒸水清洗，使其返藍；8)逐級常規乙醇脫水；9)二甲苯透明；10)中性樹膠封固。

肝糖原面積分析：采用DP71軟件(奧林巴斯公司，日本)拍攝圖片，用奧林巴斯顯微鏡圖像分析軟件Image-Pro Plus IPP 6.1進行肝組織糖原面積半定量分析。

3 結果

3.1 CCl4急性肝損傷模型大鼠肝臟系數與血清肝功能的變化 由表1可知，與正常組比較，CCl4染毒后模型組體重明顯降低(P<0.01)，肝體比增加(P>0.01)。血清肝功能結果顯示，與正常組相比，模型組的ALT與AST活性明顯升高(P<0.01)，TBil含量明顯增加(P<0.01)，Alb含量明顯降低(P<0.01)，出現明顯的肝功能損害，提示CCl4染毒成功誘導大鼠急性肝損傷模型(表1)。

3.2 CCl4急性肝損傷模型大鼠肝臟組織病理學的變化 HE染色示，正常組大鼠肝組織肝小葉結構正常、排列整齊、無出血、無肝細胞變性、壞死，未見脂肪沉積及炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝小葉結構排列紊亂，肝細胞脂肪變、氣球樣變明顯加重。Ridit分析結果顯示，與正常組相比，模型組肝細胞脂肪變與氣球樣變化明顯加重(P<0.01)。(圖1，表2)

表1 大鼠CCl4急性肝損傷模型肝臟系數與血清肝功能的影響±s)

注：*P<0.05，**P<0.01vs正常組，#P<0.05，##P<0.01vs.模型組。

表2 大鼠CCl4急性肝損傷肝細胞脂肪變

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表3 大鼠CCl4急性肝損傷常規PAS染色

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

3.3 CCl4急性肝損傷模型大鼠肝組織糖原染色的變化 常規肝糖原染色結果，正常組肝細胞胞質及胞核內可見中等量玫瑰紅色粗大顆粒(PAS染色陽性)，應用Image-Pro Plus：IPP 6.1半定量分析肝組織糖原含量占肝臟面積為32.38%±5.50%；與正常組相比，模型組肝細胞胞質及胞核內玫瑰紅色粗大顆粒明顯減少(P<0.01)，占肝臟面積為8.60%±3.34%。改良肝糖原染色提示，正常組肝細胞胞質及胞核內可見大量玫瑰紅色粗大顆粒(PAS染色陽性)，占肝臟面積為75.50%±9.02%；與正常組相比，模型組肝細胞胞質及胞核內玫瑰紅色粗大顆粒明顯減少(P<0.01)，占肝臟面積為17.61%±3.53%。在正常肝組織與模型肝組織中，改良肝糖原染色法PAS染色陽性明顯高于常規肝糖原染色法(P<0.01)。見表3與圖1。

圖1 大鼠CCl4急性肝損傷HE染色、 常規PAS染色與改良PAS染色

注：N正常組，M模型組；A：肝組織HE染色×200倍；B：肝組織常規PAS染色×200倍；C：肝組織改良PAS染色×200倍；D：肝細胞脂肪變積分分析；E：肝細胞氣球樣變積分分析；F：肝組織常規PAS染色與改良PAS染色半定量分析。與正常組相比，**P<0.01；與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

4 討論

CCl4為急性肝損傷誘導[11]，CCl4在肝內代謝裂解成三氯甲基CCl3-等自由基，這些自由基攻擊肝細胞膜磷脂內不飽和脂肪酸碳鏈上的氫原子，消耗膜脂質中的不飽和脂肪酸，大量生成脂質過氧化物，導致肝細胞損傷[12]。本實驗表明CCl4誘導大鼠急性肝損傷，表現為血清中ALT、AST活性以及T.Bil含量與正常組有顯著性升高；血清中Alb含量與正常組明顯降低。肝組織HE染色顯示，模型組大鼠肝小葉結構排列紊亂，肝細胞脂肪變、氣球樣變明顯加重。

如前所述，測定肝糖原的方法很多，其中蒽酮法受試劑、溫度、方法穩定性差等因素的影響，結果重現性不好，而且使用試劑多，溶液配制和操作過程復雜。氧化酶法檢測肝糖原含量的方法優于蒽酮法。其操作簡便，結果穩定、重復性好，適合不同動物模型肝糖原含量的檢測。但是若不用緩沖液調整水解液的pH值，直接用堿中和則往往會出現中和不足或過量的問題，很難掌握好中和點[13]。而且蒽酮法與氧化酶法均不適合肝糖原原位檢測。PAS染色法[5]是目前采用較多的肝糖原原位染色檢測，常規PAS染色法采用乙醇-醋酸-氯仿固定液(卡諾固定液)，能較好地保存糖原，但有使糖原流動到細胞一側甚至漏出的現象，一般認為是由于固定劑把細胞內的糖原推向固定劑對組織浸透的方向而造成[14]，與本實驗中常規PAS染色肝糖原偏向肝細胞一側并減少的顯示結果一致。近期我們采用糖原染液試劑盒，簡化實驗流程，肝組織不采用卡諾固定液固定直接冰凍切片，成功原位檢測肝組織糖原表達位置與水平，肝糖原均勻分布于整個肝細胞，肝糖原陽性染色明顯強于常規PAS染色。大鼠皮下注射CCl4后可使肝細胞產生化學性損傷，因此肝細胞對葡萄糖的攝取減少，肝糖原的合成亦相應減少。本研究結果提示CCl4染毒2周后大鼠體重明顯減輕、ALT與AST活性明顯升高，TBil含量明顯增加，Alb含量明顯降低，HE染色可見肝細胞脂肪變變、氣球樣變化明顯，提示CCl4染毒成功誘導大鼠急性肝損傷。常規PAS染色與改良PAS染色均提示，模型組大鼠肝糖原面積較正常組大鼠明顯減少。由于以往操作方法經常出現實驗結果不理想，為此本實驗取材于急性肝損傷的大鼠肝臟，參照常規PAS染色法，對實驗中肝糖原染色方法的固定作了探索性的改進，即采用肝組織冰凍切片，無須卡諾固定液固定，大大節省實驗流程與時間，同時，更好的保留肝組織糖原，本實驗結果表明改良PAS染色法切實可行，肝糖原陽性染色面積更符合急性肝損傷的程度。

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(2014-12-26收稿 責任編輯：洪志強)

Application of improved PAS staining in acute liver injury

Zhang Feng1, Tao Yanyan1,2, Chen Gaofeng1,2

(1InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China; 2KeyLaboratoryofLiverandKidneyDiseases(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine),MinistryofEducation,Shanghai201203,China)

Objective:To study in situ staining of glycogen by modified Periodic acid-schiff (PAS) staining on evaluating acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in rats.Methods:Rats were randomly divided into 2 groups: normal group and model group. Except normal rats, all the other rats in model group were injected subcutaneously 100% CCl4 3mL/kg once, then 50% CCl4 2mL/kg two times a week for 4 times. All the rats were sacrificed on the 15th day. Liver body ratio of rats was calculated; The serum parameters of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total bilirubin (TBil), albumin (Alb) were assayed. Hepatic inflammation was observed with HE staining. Hepatic glycogen was stained by routine PAS staining and improved PAS staining. Results:Compared with the normal group, the activities of ALT and AST and TBil content increased significantly (P< 0.05). Alb content was significantly decreased compared with the normal group (P<0.05). HE staining showed that serious structural damage, hepatic steatosis and ballooning degeneration were seen in model group. Routine PAS staining showed that PAS positive staining area accounted for 32.38%±5.50% in normal group. Compared with the normal group, PAS positive staining area decreased significantly (8.60%±3.34 %,P< 0.01).Improved PAS staining showed that PAS positive staining area accounted for 75 .50%±9.02 % in normal group. Compared with the normal group, Improved PAS positive staining area decreased significantly (17.61%±3.53%,P< 0.01). In normal group and model group, improved hepatic glycogen staining showed positive staining of PAS was significantly higher than that of routine hepatic glycogen staining (P<0.01). This suggests that the improved PAS staining of liver glycogen positive stained area more truly reflected the degree of acute liver injury.Conclusion:The improved of Periodic acid-schiff (PAS) staining method is helpful to improve the evaluation quality degree of acute hepatic injury.

Hepatic glycogen; Acute hepatic injury; Periodic acid-schiff (PAS); Improvement

國家自然科學基金項目(編號：81102701)；上海中醫藥大學實驗技術人才隊伍建設資助計劃[編號：上中醫(2012)人字18號]；上海市中醫臨床重點實驗室(編號：14DZ2273200)

R-331

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.007