順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的實驗研究

張麗娟　陶仕英　趙丕文　冒湘琳

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

實驗研究

順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的實驗研究

張麗娟陶仕英趙丕文冒湘琳

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

目的：探討采用臨床常用藥物順鉑建立化療性損傷卵巢早衰動物模型的方法。方法：通過觀察陰道脫落細胞選取有正常動情周期的雌性SD大鼠60只隨機分為正常組，低劑量組和高劑量組。按4 mg/kg和6 mg/kg分別給予低、高劑量組腹腔注射順鉑注射液，每周1次，連續2周。每天觀察大鼠一般情況，體重，動情周期。取材后測定血清中E2、FSH、LH和Pro含量，光鏡下觀察卵巢病理組織形態變化。結果：體重下降，動情周期紊亂，動情間期延長。與正常比較，高、低劑量組E2水平不同程度降低，FSH、LH水平升高(P<0.05)。孕酮含量各組比較無統計學意義(P>0.05)。卵泡計數減少。結論：化療藥物順鉑可致大鼠卵巢功能明顯衰退，卵泡發育障礙，生殖能力受損。為基礎研究建立穩定的卵巢早衰動物模型提供一種操作簡單，成功率高，結果可靠的實驗方法。

順鉑；卵巢早衰；大鼠；動物模型

卵巢功能早衰(Premature Ovarian Failure，POF)是指婦女青春期發育后若在40歲前發生閉經、卵巢萎縮、體內雌激素水平低落、促性腺激素水平高達絕經期水平的現象。是常見的婦科內分泌疾病，近年來研究證實，由于卵巢早衰患者卵巢分泌的雌激素量減少，即可導致一些其他疾病，如骨質疏松、泌尿生殖道萎縮、脂質代謝紊亂、心血管類等疾病[1-4]。

順鉑是一種可以用來治療多種腫瘤的化療藥物，但又有一定的不良反應，與卵巢的損害有直接關系[5-6]。有研究表明順鉑可誘導卵巢細胞凋亡，引起組織壞死，從而導致卵巢功能早衰[7-9]。本實驗根據這一原理建立化療性損傷卵巢早衰動物模型。

1　實驗材料

1.1實驗動物健康雌性SD大鼠60只，體重190～210 g，均為清潔動物，檢疫合格，由北京維通利華實驗技術有限公司提供。動物飼養在室溫、自然光照的清潔級實驗室內，食水充足。飼料為維通利華提供的普通大鼠飼料，飲水為去離子水。

1.2實驗試劑注射用順鉑(CDDP)，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產，批號：H37021358。注射用順鉑用生理鹽水配制成0.5 mg/mL，按4 mg/kg、6 mg/kg腹腔注射。FSH批號：2014120；LH批號：20140120；Pro批號：1220，廠家：北京北方生物技術研究所。E2批號：0120，廠家：深圳拉爾文。亞甲基藍批號：A202031，國產。

2　實驗方法

2.1實驗對象篩選適應性喂養3 d后，對大鼠進行陰道脫落細胞學涂片，連續7 d光鏡下觀察，篩選出動情周期正常的60只健康雌性大鼠進入正式實驗。隨機分為正常組，低劑量組和高劑量組，每組20只。

2.2化療性損傷卵巢模型的建立低劑量組和高劑量組分別按4 mg/kg、6 mg/kg腹腔注射順鉑注射液，正常組腹腔注射1 mL生理鹽水。每周同一時間注射1次，連續2周。造模期間每天定時進行陰道涂片實驗，觀察動情周期的變化，以確定造模成功。

2.3觀察大鼠情況每日觀察并記錄大鼠的進食進水情況，生命體征，行為活動及體毛變化。每日上午9點進行陰道涂片實驗和體重測量。

2.4取材第2次注射7 d后，進行取材。大鼠腹主動脈取血，以3 000 r/min速度離心10 min，分離提取上層血清，存于-20 ℃冰箱待測。取大鼠雙側卵巢至于4%甲醛溶液中固定，經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，進行石蠟切片的制備。

2.5指標檢測

2.5.1動情周期檢測將棉簽蘸取少量生理鹽水徐徐插入大鼠陰道取少量分泌物，迅速在載玻片上朝單側轉動，滴少量亞甲基藍溶液光鏡下觀察。

2.5.2激素水平檢測采用放免檢測FSH、E2、Pro和LH水平含量，實驗步驟按照試劑說明進行試驗。1)包被：用0.05 M PH9牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，3 min/次。2)加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗滌。(同時做空白孔對照)。3)加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。4)加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。5)終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05 mL。6)結果判定：在ELISA檢測儀上，于450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔值。

2.5.3HE染色觀察各級卵泡1)脫蠟：將石蠟切片至于二甲苯I、II、III中各10 min進行脫蠟。2)復水：浸入梯度酒精和去離子水各3 min。3)染色：蘇木素溶液中5～10 min沖洗，鹽酸酒精分色3 s，沖水5～10 min反藍。伊紅溶液中1～3 min，蒸餾水洗2 s。4)脫水：95%乙醇I、II各5 s，無水乙醇I、II各5 min。5)固定：二甲苯I、II、III各5 min。6)封片：中性樹膠封片，靜置12 h。鏡下觀察各級卵泡。

3　結果

3.1大鼠一般情況正常組大鼠活動、進食正常，體毛光滑有光澤，有正常的動情周期；不同劑量組大鼠給藥后體重均有不同程度下降，行動緩慢，喜弓背、蜷縮，食欲下降，體毛晦暗無光澤，高劑量組更為明顯。正常組大鼠注射生理鹽水體重增加迅速且平穩，不同劑量組注射順鉑4 d后較正常組體重均有不同程度的下降，而高劑量組在注射順鉑8 d體重較低劑量組明顯下降，各組大鼠體重變化(見圖1)。

圖1　各組大鼠體重變化對比柱狀圖

3.2不同劑量對大鼠動情周期的影響正常大鼠動情周期[10]4～5 d。分為四個階段，動情前期：橢圓形有核上皮細胞占絕大多數，白細胞和角化上皮細胞很少。動情期：角化上皮細胞占多大多數，由散在增至集塊，白細胞和有核上皮細胞很少。動情后期：片狀角化上皮細胞，有核上皮細胞和白細胞3種都有，無太大差異。動情間期：白細胞占絕大多數，有核上皮細胞和角化上皮細胞很少(見圖2)。低劑量組用藥后動情周期紊亂，動情間期延長，動情縮短。但停用藥1周后部分大鼠動情周期有所恢復。高劑量組大鼠動情周期延長，甚至長期停留在動情間期，不出現動情期。停藥后1周動情周期沒有恢復。

圖2　光鏡下40倍大鼠動情周期陰道涂片

3.3大鼠血清中LH、FSH、E2及孕酮含量的變化從表1可以看出，高劑量組與正常組比較大鼠血的FSH值升高有統計學意義(P<0.05)，卵泡對FSH敏感度降低是卵巢功能衰退的早期征象[5]。低劑量組血清中FSH較正常組差異無統計學意義(P>0.05)。順鉑對大鼠血清中孕酮含量的影響，給藥前后各組均無明顯差異。E2水平在給藥后2組差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1　大鼠血清LH、FSH、E2及孕酮含量

3.4各大鼠卵巢形態學影響正常組大鼠卵巢增大，各級卵泡生長活躍，可見各級卵泡，且大多數為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡，閉鎖卵泡很少。且卵泡顆粒細胞層較多，卵泡液豐富，黃體發育較好。而低劑量組原始卵泡和初級卵泡減少，閉鎖卵泡增加，黃體數量減少。高劑量組可見很少次級卵泡和成熟卵泡，大多數為閉鎖卵泡，卵泡顆粒細胞層明顯變薄，黃體明顯減少。(見圖3)

圖3　光鏡下40倍HE染色

4　討論

卵巢早衰是一種多病因所致的卵巢功能衰竭，但其具體發病機理仍不清楚，所以模型研究是深入探討疾病發生和發展的必要條件。有研究表明[11]順鉑對不同發育時期的卵泡有不同程度的損傷，并可導致血清中相應激素水平發生變化。因此本實驗對化療藥物順鉑建立大鼠卵巢早衰模型方法及可行性進行探討。

從實驗結果可以看出：大鼠在給予順鉑造模后[12-13]表現為弓背、蜷縮，行動緩慢，食欲下降，體毛枯黃。陰道涂片顯示：低劑量組用藥后動情，動情周期延長，但停用藥一周后部分大鼠動情周期有所恢復。高劑量組大鼠不僅長期停滯在動情間期，且行陰道涂片時可感到陰道松弛，偶見血性分泌物。以上表現與臨床上婦女陰道成老年性改變相似。

FSH是檢測卵巢早衰的常用指標，也用來判斷損傷程度[14-15]。卵泡對FSH敏感度降低是卵巢功能衰退的早期征象[16-17]，與臨床上血虛型閉經相似[18]。本研究結果顯示低劑量組大鼠血清中FSH水平較正常組有所升高，但無統計學意義(P>0.05)；而高劑量組明顯高于正常組，有統計學意義(P<0.05)。E2可促進卵泡生長，改善卵巢功能，造模后血清中E2水平都有所降低，高劑量組更為明顯，自然導致卵泡發育，使卵巢受損。

卵巢功能完成的物質基礎是初級卵泡的存在及發育，初級卵泡由原始卵泡發育而來，原始卵泡不能再生，他的破壞終將導致卵巢功能早衰[19-20]。實驗結果高劑量組可見原始卵泡，次級卵泡和成熟卵泡顯著減少，閉鎖卵泡明顯增加。提示：順鉑刺激了凋亡機制，導致大量卵泡停止發育繼而凋亡。

綜上所述，本實驗研究給予大鼠不同劑量的順鉑注射后，卵巢功能出現不同程度的損傷，而高劑量組模型更為理想。本研究優勢在于成功率高，模型穩定，資源易得，費用低廉，可作為探討卵巢早衰發病機制的動物模型。

[1]馬麗靈,阮祥燕.100例卵巢早衰相關因素的調查分析[J].實用婦產科雜志,2009,25(4):212-215.

[2]楊躍紅,林建,易笑望.連續2-4年激素治療卵巢早衰的療效性和安全性觀察[J].中國醫師雜志，2005,7(7):997-998.

[3]金志春,黃曉桃,楊雅琴,等.補腎活血方聯合雌激素治療卵巢早衰的臨床研究[J].中國中西醫結合雜志,2013,33(5)：0586-0589.

[4]騰秀香.卵巢早衰病因病機的中醫學觀點[J].北京中醫醫院院刊,2012,9(7):64-65.

[5]汪玉珍.導師王翠霞教授治療卵巢早衰經驗總結[J].遼寧中醫藥大學學報,2012,5(11):32-33.

[6]Yucebilgin MS，Terek MC，Ozsaran A，et al.Effect of chemotherapy on prinnorrlial follicular reserve of ral，an animal model of premature ovarian failure infertility[J].Aust NZJ Obstet Gynaecol，2004，44(1):6-9.

[7]柳友清,邢輝,韓曉兵,等.順鉑誘導宮頸癌Hela細胞凋亡及其作用機制的研究[J].中國腫瘤臨床,2006,33(1):1-4.

[8]曲秀芬,王兵兵,張蕾,等.卵巢早衰的現代醫學研究進展[J].中國婦幼保健,2009,24(7):1005-1007.

[9]周華,趙春梅.中西醫治療卵巢早衰臨床研究述略[J].中醫藥學刊,2004,5(22):903-905.

[10]Shimoako T，Kamekura S，Chikuda H，et al.Impairment of bone healing by insulin receptor substrate-1 deficiency[J].J Biol Chem,2004,279(15):15314-15322.

[11]范燕燕,林守清,何仲,等.卵巢功能衰退過程中血清激素和卵巢大小的改變[J].中國婦幼保健研究,2012,23(2):9.

[12]曹金鳳,郝紅娟,王惠蘭,等.順鉑、依托泊苷、長春新堿、博來霉素對人卵巢顆粒細胞影響及其機制[J].中國實用婦科與產科雜志,2012,28(11):835-838.

[13]Laura P，Suman R，Nafi D，et al.Anti-Müllerian hormone reduces follicle sensitivity to follicle-stimulating hormone in human granulosa cells[J].Fertil Steril，2011,96(5):1246-1251.

[14]王冰,蔡霞.抑制素B與卵巢早衰的研究進展[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2009,28(3):184-186,193.

[15]Williams GT.Programmed cell death:apoptosis and oncogenesis[J].Cell，1991，65(7):1097-1098.

[16]Ray R,Chen G,Veide CV，et al.BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/Bax and induces cell death independent of a Bcl-2 homology 3(BH3)domain at both mitochondrial and nonmitochon-drial sites[J].Biol Chem，2000,275(2):1439-1448.

[17]Borovskaya TG，Goldberg VE，Fomina TI，et al.Morphologi-cal and functional state of rat varies in early and late periods[J].after administration of platinum cytostatics.Bull Exp Biol Med,2004,137(4):331-5.

[18]盧曉男,徐向榮,林麗君.補腎二仙湯治療卵巢早衰的臨床觀察[J].中國中西醫結合雜志,2008,28(7):594-596.

[19]王世閬.卵巢疾病[M].北京:人民衛生出版社,2004:3-16.

[20]李秀華,雷小敏.卵巢早衰與免疫[J].中國老年學雜志,2004,24(8):776-778.

(2014-09-28收稿責任編輯：張文婷)

Experimental study of Cisplatin in Establishment of Premature Ovarian Failure Model

Zhang Lijuan，Tao Shiying，Zhao Piwen，Mao Xianglin

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To explore the method of establishing animal model with premature ovarian failure due to chemotherapy damage by using cisplatin clinical medicine. Methods:According to the observation of vaginal exfoliated cells, we divided 60 female SD rats with normal estrous cycle into normal group, low dose group and high dose group randomly. Low dose group were given 4 mg·kg-1intraperitoneal injection of Cisplatin and high dose group 6 mg·kg-1respectively. The injection was given once a week and lasting for two weeks. The general conditions, weight, estrous cycle of the rats were observed every day. The serum levels of E2, FSH, LH and progesterone levels were detected after ovarian. The pathological and morphological changes were also observed under optical microscope. Results: Weight loss, estrous cycle disorder, anestrus prolongation were observed. Compared with normal status, the E2levels of both high and low dose group decreased in different degree, while FSH, LH levels elevated.(P<0.05). No significant difference of progesterone was observed in both groups(P>0.05). Follicle also decreased. Conclusion: The declination of ovarian function of rats with cisplatin chemotherapy drugs is obvious, follicle development and reproductive capacity are impaired, which provides a simple, high success rated, and reliable method for animal model with premature ovarian failure.

Cisplatin; Premature ovary failure; Rat; Animal model

國家自然科學基金項目(編號：81273887)；教育部大學生創新性實驗計劃項目(編號：201310026056)；北京中醫藥大學自主選題項目(編號：2013-JYBZZ-JS-006)

張麗娟(1987—)，女，北京中醫藥大學2012級在讀研究生，研究方向：中醫婦科，E-mail：251197571@qq.com

陶仕英(1970—)，女，博士，副教授，研究方向：從事中西醫基礎研究，E-mail：taoshiying1970@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.029