響應(yīng)面法優(yōu)化一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取工藝

昌妍希 張 屏 包保全，2

(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特，010100； 2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，通遼，028000)

響應(yīng)面法優(yōu)化一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取工藝

昌妍希1張 屏1包保全1，2

(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特，010100； 2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，通遼，028000)

目的：利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取工藝參數(shù)。方法：采取酸水浸泡提取法、離子交換法及索氏抽提法結(jié)合的方法對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿提取進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過單因素法與響應(yīng)面Box-Behnken法選擇初始參數(shù)，之后利用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸分析對(duì)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果：最優(yōu)參數(shù)為提取次數(shù)3次，乙醇濃度85%，酸濃度4.7‰。結(jié)論：所優(yōu)選的提取工藝具有良好的可行性。

一葉萩堿；提取工藝；優(yōu)化設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法；最優(yōu)參數(shù)

一葉萩(SuffrutescentSecurinegaTwig)又名葉底珠，狗杏條，為大戟科葉下珠族白飯樹屬植物。其主要生物活性成分為一葉萩堿，屬于吲哚里西啶類生物堿，具有良好的抗腫瘤活性和興奮中樞神經(jīng)作用，應(yīng)用前景十分廣闊[3]。一葉萩總堿主要從一葉萩種子中用溶劑法提取獲得，傳統(tǒng)的提取工藝周期長，有機(jī)溶劑用量多，而得率僅為萬分之四左右[4]。并且一葉萩種子殼中也含有一葉萩堿，傳統(tǒng)提取將其作為廢料處理。我們從一葉萩種子殼中提取一葉萩堿，采用新的提取方法，用Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)并利用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得到了優(yōu)化的提取方案。該方法對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取進(jìn)行了條件優(yōu)化，提高了一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率，降低了生產(chǎn)成本，為大規(guī)模化提取生物堿奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 一葉萩植物種子2012年10月采摘自吉林省集安市，自然晾干，取種子殼。732磺酸型陽離子樹脂(河北華眾化工有限公司)；乙醇；冰醋酸；乙酸乙酯；碘化鉍鉀；濃鹽酸；氫氧化鈉；乙酸乙酯；石油醚；硅鎢酸；苦味酸；氯仿；甲醇(均購自北京鼎國試劑有限公司)。數(shù)顯恒溫水浴鍋H-88(國華電器有限公司)；電子天平METTLER TOLEDO(上海托利多儀器有限公司)；HL—2B恒流泵(上海實(shí)業(yè)精科有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-99(上海亞榮生化儀器)；FW177微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱GZX-9240(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；KQ-50B超聲儀(上海司樂儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)732磺酸型陽離子樹脂的預(yù)處理 將新樹脂用蒸餾水反復(fù)清洗，每隔約10 min換水1次，水洗至水不帶顏色且泡沫很少時(shí)為止。之后用5%的鹽酸浸泡，浸泡1 h后用蒸餾水洗至中性。再用5%氫氧化鈉浸泡，浸泡1 h后用蒸餾水洗至中性。用5%的鹽酸將樹脂轉(zhuǎn)成氫型，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.2 對(duì)一葉萩種子殼的預(yù)處理 將植物一葉萩種子殼晾干，放置干燥箱，75 ℃干燥11 h后用粉碎機(jī)粉碎成一葉萩種子殼粉末，過40目篩備用。

1.2.3 對(duì)樹脂柱的裝柱流程 本實(shí)驗(yàn)采用濕法裝柱。將柱子垂直放置，在交換柱底部篩板上部放入一片小濾紙，用漏斗將樹脂以一定的速度加入交換柱中，等到樹脂顆粒充分下沉后，在交換柱的上面再覆蓋一層脫脂棉，最后在交換柱的上部加入含有一葉萩堿的酸液并且控制酸液流速1 mL/min。

1.3 一葉萩種子殼中一葉萩堿提取工藝流程 粉碎后過40目篩的一葉萩種子殼用500 mL鹽酸溶液浸潤12 h后超聲25 min，過濾，取濾液。將酸水液通過732磺酸型陽離子交換柱，交換完全后將樹脂水洗至澄明狀態(tài)，室溫風(fēng)干備用。風(fēng)干后的樹脂放入索氏提取器中用200 mL乙醇溶液回流洗脫1.5 h，減壓回收溶劑，濃溶液用少量0.1%鹽酸溶液洗脫后再用5%氫氧化鈉溶液中和，等比乙酸乙酯萃取。重結(jié)晶精制提純得一葉萩堿晶體。

1.4 單因素試驗(yàn) 取一葉萩種子殼粉末100 g，以一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究萃取次數(shù)，乙醇濃度，酸濃度3個(gè)因素對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，將單因素試驗(yàn)中對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率影響明顯的因素進(jìn)行分析試驗(yàn)，以萃取次數(shù)，乙醇濃度，酸濃度3個(gè)因素為自變量，一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。各參數(shù)所代表因素及其水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼表及水平值

1.6 模型驗(yàn)證 通過響應(yīng)面法優(yōu)化一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，比較模型預(yù)測值和試驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，確定最佳試驗(yàn)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)分別考察了萃取次數(shù)，乙醇濃度，酸濃度3個(gè)因素對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率影響，如圖1至圖3所示。

圖1 萃取次數(shù)對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的影響

圖3 酸濃度對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的影響

如圖1所示，隨著萃取次數(shù)的增加，一葉萩種子殼中一葉萩堿得率也在增加，萃取3次一葉萩堿得率增長的幅度很大。當(dāng)萃取次數(shù)超過3以后，得率增加量微乎其微，原因是隨著萃取次數(shù)的增加，一葉萩堿幾乎全部溶解在萃取液中，所以對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的增加沒有明顯的作用。

如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，一葉萩種子殼中一葉萩堿得率不斷增加，當(dāng)乙醇濃度為85%的時(shí)候一葉萩種子殼中一葉萩堿得率幾乎不再增加，85%是其濃度的最大值點(diǎn)。

如圖3所示，隨著酸水液濃度的增加，一葉萩種子殼中一葉萩堿得率明顯增加，但在酸水液的濃度大于4.7‰后，一葉萩種子殼中一葉萩堿得率隨著酸水液濃度的增大而降低。說明在4.7‰時(shí)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率最高，濃度在增大一葉萩種子殼中一葉萩堿得率反而減小可能原因是酸水使一葉萩堿發(fā)生了變化。

表2 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面Box-Behnken方差分析表

注：(P<0.05)*為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(P<0.01)**為差異有顯著性意義；(P<0.0001)***為差異有非常顯著性意義

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 二次回歸模型擬合以及方差分析 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以一葉萩種子殼中一葉萩堿得率為因變量，以提取次數(shù)、乙醇濃度，酸濃度為自變量建立回歸方程：

Y=0.067+2.025×10-3A-2.875×10-3B-1.500×10-3C-6.750×10-3AB+9.250×10-3AC+6.350×10-3BC-6.255×10-3A2-0.022B2-7.255×10-3C2

回歸方程的決定系數(shù)R2為0.9854。并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，當(dāng)P<0.05，表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，P<0.01，表示該項(xiàng)指標(biāo)差異有顯著性意義，P<0.000 1，表示該項(xiàng)指標(biāo)差異有非常顯著性意義。表3表明，一葉萩種子殼中一葉萩堿與試驗(yàn)中3個(gè)因素的回歸方程F值為52.58，整體模型“Prob﹥F”值<0.000 1，表明該方程模型差異有非常顯著性意義。

萃取次數(shù)對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿產(chǎn)量影響不顯著，乙醇濃度對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率影響顯著，酸濃度對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿產(chǎn)量影響不顯著；在交互相中萃取次數(shù)和乙醇濃度的交互影響極顯著，萃取次數(shù)和酸濃度的交互影響極顯著；乙醇濃度與酸濃度交互影響極顯著；在二次項(xiàng)中，萃取次數(shù)，酸濃度的影響極顯著，乙醇濃度的影響差異極顯著。同時(shí)，表3在響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果條件下，反映了各因素顯著性對(duì)響應(yīng)值的影響。失擬項(xiàng)“Prob>F”值>0.05，說明模型方程擬合度良好，能夠很好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，所以可以使用本模型來分析響應(yīng)值的變化。

2.2.2 響應(yīng)曲面交互作用分析 由圖4可以看出，萃取次數(shù)和乙醇濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿含量的影響極顯著。實(shí)驗(yàn)中通過控制萃取次數(shù)和乙醇濃度來獲得較高一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率，當(dāng)萃取次數(shù)控制在3次，乙醇濃度控制在85%時(shí)，可以獲得一葉萩種子殼中一葉萩堿的最大得率。

圖4 萃取次數(shù)與乙醇濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的響應(yīng)面和等高線圖

圖5 萃取次數(shù)與酸濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的響應(yīng)面和等高線圖

由圖5可以看出，萃取次數(shù)和酸濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿含量的影響極顯著。實(shí)驗(yàn)中通過控制萃取次數(shù)和濃度酸來獲得較高一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率，當(dāng)萃取次數(shù)控制在3次，酸濃度控制在4‰時(shí)，可以獲得一葉萩種子殼中一葉萩堿的最大得率。

圖6 乙醇濃度與酸濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的響應(yīng)面和等高線圖

由圖6可以看出，乙醇濃度和酸濃度的交互作用對(duì)一葉萩種子殼中一葉萩堿含量的影響極顯著。實(shí)驗(yàn)中通過控制乙醇濃度和酸濃度來獲得較高一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率，當(dāng)乙醇濃度控制在85%時(shí)，酸濃度控制在4‰，可以獲得一葉萩種子殼中一葉萩堿的最大得率。

3 討論

中藥一葉萩具有活血舒筋、健脾益腎之功效，用于治療風(fēng)濕腰痛，四肢麻痹和小兒疳積等[5]，最新研究表明其對(duì)老年癡呆癥也有潛在的治療作用。其主要活性成分一葉萩堿具有中樞興奮作用，適量劑量注射到人體中能提高人體神經(jīng)元反射的興奮性，加強(qiáng)人體神經(jīng)系統(tǒng)的條件反射區(qū)域，有效的縮短神經(jīng)系統(tǒng)從感知外界刺激到相應(yīng)做出反應(yīng)的時(shí)間，能增強(qiáng)學(xué)習(xí)新事物的能力并相應(yīng)的提高記憶力，也能顯著改善飲酒之后對(duì)大腦造成的記憶重新再現(xiàn)性障礙。一葉萩堿還具有一定的抑制腫瘤作用，一葉萩堿與環(huán)磷酰胺(CTX)結(jié)合之后使用有明顯的抗腫瘤效果[6]。鑒于以上臨床藥用價(jià)值，優(yōu)化一葉萩堿的提取工藝并提高其得率有著重要意義。

響應(yīng)面是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法，其優(yōu)點(diǎn)是可不必連續(xù)進(jìn)行多次試驗(yàn)[7]，用最少的實(shí)驗(yàn)組合數(shù)得出因素與響應(yīng)值的回歸方程，本試驗(yàn)選擇該設(shè)計(jì)方法進(jìn)行一葉萩種子殼中一葉萩堿的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并通過回歸方程繪制出了響應(yīng)面與等高線圖[8]，可以直接得出影響因素的變化規(guī)律，清晰準(zhǔn)確[9]。該方法與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，達(dá)到了有效節(jié)約溶劑，節(jié)省能源，減少工作量，提高工作效率并提高了一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的目的。

實(shí)驗(yàn)過程中，在用乙醇溶液水浴回流提取一葉萩種子殼中的一葉萩堿時(shí)，可能有部分一葉萩堿隨著乙醇溶液混合蒸發(fā)，導(dǎo)致了一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的下降。此問題在大規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)仍需考慮解決方案。

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)方法，以一葉萩種子殼中一葉萩堿的得率為指標(biāo)，得出提取的最優(yōu)條件：萃取次數(shù)3.49次，乙醇濃度83.49%，酸濃度4.63‰，模型預(yù)測得率為0.066 76%。考慮到實(shí)際操作的可行性，條件變更為：提取次數(shù)3次，乙醇濃度85%，酸濃度4.7‰。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，將一葉萩種子殼中一葉萩堿在修正后的條件下提取3次，測得一葉萩種子殼中一葉萩堿得率的平均值為0.067%，與模型預(yù)測值基本一致，證實(shí)響應(yīng)面Box-Behnken法在優(yōu)化一葉萩種子殼中一葉萩堿提取工藝中具有良好的可行性[10]。

[1]劉衛(wèi)軍，顧振綸，周文軒，等.一葉萩堿的抑瘤和拮抗環(huán)磷酰胺毒性作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1997，13(6):529-530.

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(2014-11-04收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Extraction Optimization of Securinine from Suffrutescent Securinega Seeds by Response Surface Method

Chang Yanxi1, Zhang Ping1, Bao Baoquan1,2

(1CollegeofPharmacy,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China； 2CollegeofMongolianMedicine,InnerMongoliaUniversityfortheNationalities,Tongliao028000,China)

Objective:To optimize the extraction of securinine from the seeds of Suffrutescent securinega by response surface method. Methods: The seeds were soaked and extracted by acid water, and the extraction was subjected to ion exchange column. Crude securinine was further condensed by Saxhlet extraction method. Single factor experiment and Box-Behnken Design method were used to determine the arrangemengt of parameters. Quadratic regression analysis were used to optimize the data by Design-Expert software. Results: The optimal parameter of production technology is finally determined as three times of extraction, with 85% ethanol concentration and 4.7‰ acid concentration. Conclusion: The optimized extraction technology is practicable.

Securinine; Extraction Technology; Optimized design; Box-Behnken design; Optimal parameter

教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)項(xiàng)目“基于四味土木香散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的新劑型開發(fā)”(編號(hào)：2010LXHG21)

昌妍希，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院研究生，E-mail:316646637@qq.com

包保全，博士，教授，研究方向：蒙藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及資源研究，E-mail:baobaoquan@aliyun.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.031