氣候突變對腦卒中大鼠發病的影響

李立華 劉曉燕 郭霞珍 楊云霜

(1 北京市順義區中醫醫院，北京，101300； 2 北京中醫藥大學，北京，100029； 3 第二炮兵總醫院中醫科，北京，100088)

氣候突變對腦卒中大鼠發病的影響

李立華1劉曉燕2郭霞珍2楊云霜3

(1 北京市順義區中醫醫院，北京，101300； 2 北京中醫藥大學，北京，100029； 3 第二炮兵總醫院中醫科，北京，100088)

目的：改進易卒中型腎性高血壓大鼠的造模方法，并在此研究上氣候突變對腦卒中大鼠發病的影響。方法：不完全暴露腎臟，以體表定位的方法尋找雙腎動脈，復制易卒中型腎性高血壓大鼠模型(RHRSP)，待大鼠血壓升高到一定程度把它們放置于人工模擬氣候箱中，給予氣溫驟然升降的刺激，觀察腦卒中大鼠發病情況。結果：改進后的造模方法使大鼠術后死亡率低，血壓升高快，卒中率高。氣溫驟升組的模型組大鼠血壓值在造模45 d左右穩定在220～230 mmHg之間，氣溫驟降組的模型組大鼠血壓值穩定在205～220 mmHg之間；模型組與生理組，假手術組的血壓值有統計學意義(P<0.05)。氣溫驟然升降的變化影響RHRSP腦梗死及腦出血發生的幾率。結論：采用體表定位的方法，可以減少大鼠的并發癥及死亡率并且提高大鼠的腦卒中發生率。血壓升高、氣候突變的刺激是腦血管疾病發病的一個重要誘因；氣溫驟然升降可導致兩種不同的結局：氣溫驟升導致RHRSP發生腦梗死的幾率稍高，而氣溫驟降導致該模型大鼠腦出血發病率稍高。

氣候突變；腦卒中；易卒中型腎性高血壓大鼠

腦卒中一直以來都是發病率、病死率、致殘率極高的一種疾病，它的發病與氣候，季節變化有密切的關系[1-8]。不少學者已對這種相關關系做了研究，得出結論：夏季腦梗死發病率高，冬季腦出血發病率高。但其中的相關機制究竟是怎樣的，目前研究闡明的較少，需要科學研究進一步探討。因此，本課題組在前期的工作基礎上欲對此機制進行研究。首先需要建立與人體發生腦卒中過程較為相似的大鼠模型-暨成功復制易卒中型腎性高血壓大鼠模型。其次，研究氣候突變(驟然升降)對該模型大鼠發病率的影響。通過以上研究，為進一步闡明腦卒中的發生機理做鋪墊，同時也可在一定程度上揭示氣候因素在腦血管病發病的重要地位。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 體重80～100 g的健康雄性SD大鼠共200只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號CKX(京)2008-0001。隨機分為氣溫驟升組40只，氣溫驟降組40只，假手術組各30只，生理組各30只。在溫度為25 ℃(夏季)和17 ℃(冬季)的動物房中以普通鼠全價顆粒飼料喂養，自由飲用自來水。

1.1.2 試劑和儀器 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色劑)；BP-2006A大鼠無創血壓計(Softron，日本)；人工模擬氣候箱(北京中醫藥大學基礎醫學院自主設計)；內徑為0.30 mm的U型銀夾(中山醫科大學神經內科研制)。

1.2 實驗方法

1.2.1 易卒中型腎性高血壓大鼠模型的改進[9-10]常規被皮消毒后，使用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔注射，待大鼠麻醉后沿其胸骨劍突下1 cm處向下行縱行一長約1～1.5 cm的切口，打開腹腔。依次暴露下腔靜脈、左腎靜脈、腹主動脈、部分動靜脈分支，用棉球向下輕壓腎靜脈直至后方動脈顯露出來，若腎動、靜脈已成功分離，可用玻璃分針挑起左腎動脈，然后用預先準備的0.3 mm(內徑)銀夾夾閉該處動脈。右腎動脈的定位較左邊稍困難，原因是：此動脈位于腸系膜上動脈和下腔靜脈之間。首先定位腸系膜上動脈(該動脈下方有一根腹主動脈分支，這個分支較細)，此即右腎動脈。找到右側腎動脈后，用同樣的方法擦拭分離周邊組織，后上銀夾鉗夾。夾銀夾需要注意的事項：第一，確認雙側腎動脈都被放置于銀夾的“U”中，銀夾頭部只需要輕輕閉合。第二，檢查大鼠血流是否通暢，是否無栓塞，大鼠腹腔內有無出血，夾置于其中的腎動脈有無扭轉。銀夾擺放平整后，仔細檢查腹腔，將腹腔中的棉球一一取出，創口處灑少量青霉素，然后逐層縫合，肌層采用8字縫合，皮膚采用連續縫合。術后三天每天注射青霉素5 000～10 000 U，預防感染。

1.2.2 血壓監測及氣候突變的處理 大鼠造模后，3組大鼠都從第3周開始每周測量一次血壓(收縮壓)，進行氣溫驟升刺激的觀察90 d，進行氣溫驟降的觀察45 d。在進入人工模擬氣候箱前測量體重、血壓，觀察大鼠的一般情況。采用Longa5分制法評分，將Longa=0的模型組大鼠、假手術組和生理組的大鼠都置于人工氣候箱中，分別在溫度25 ℃和17 ℃，相對濕度60%的環境中飼養2周。將氣溫驟升組的溫度設置為37 ℃ 8 h(日最高氣溫≥35 ℃時定義為高溫天氣)，溫度恢復至25 ℃，第2 d重復升溫過程1次，同樣為8 h，隨后出箱。將氣溫驟降組的溫度設置為5 ℃ 8 h(24 h內降溫10 ℃以上為寒潮天氣)，溫度恢復至17 ℃，第2天重復降溫過程1次，同樣為8 h，隨后出箱。3組大鼠都于出箱后立即取材。

1.2.3 TTC染色及病理檢查 大鼠麻醉(麻醉藥物：10%水合氯醛；劑量：300 mg/kg)。采血(取血方法：大鼠腹主動脈采血)-小閘刀斷頭取腦。將大鼠全腦放置于(溫度設定為-20 ℃的)冰箱冷凍10 min。10 min后大腦組織稍稍變硬，此時固定較易，用刀片將其均分切成2毫米厚的薄片。在進行TTC染色之前，先觀察每只大鼠腦組織有無出血，無出血的組織塊放置于TTC染液瓶中觀察其梗死情況。最后將余下的大鼠腦組織放置于制備好的4%的多聚甲醛溶液中進行固定(時間大約2周)，石蠟切片后HE染色，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 模型改進 此造模方法與以往的文獻所報導的大鼠模型相比：血壓升高的更快，發生卒中的時間較短，最早發生卒中的時間是造模后4周。

2.2 氣溫驟升

2.2.1 氣溫驟升刺激后大鼠的整體狀態、血壓變化(見表1) 生理組大鼠在氣溫升高前的Bp均值為(129.30±3.95) mmHg，而同種狀態下，假手術組大鼠模型的Bp均值為(105.10±2.94) mmHg，RHRSP模型組的血壓為(226.07±8.91) mmHg。將人工氣候模擬箱的溫度設置成37 ℃后的1 h，這3組大鼠均出現燥熱、易激惹現象：毛發豎起，口渴欲飲水，活動較溫度刺激前明顯增多，來回跳動、齜牙咧嘴、易攻擊同伴。待升溫刺激結束后各組大鼠逐漸趨于平靜，蜷臥于鼠籠中。每個模型組大鼠在溫度升高刺激后Bp值有不同程度升高。

2.2.2 卒中情況 3組大鼠在模型復制成功后90 d均給與37 ℃驟然升溫的刺激，溫度刺激結束后發現：RHRSP組腦梗死發生率為45%。另外，在肉眼觀察下，發現有2只大鼠大腦組織出現大片出血灶。

2.2.3 大鼠腦組織的病理變化(見圖1) 正常組大鼠腦組織被TTC染色劑染成紅色。發生腦梗死的腦組織在染色時無法著色,肉眼觀察下表現為白色；而光鏡下表現為膠質細胞大量增生。出血的腦組織不需要放置在TTC染色液中。肉眼可看到大小不等的紅色組織，呈點狀、斑塊狀、圓球狀；在光鏡下則表現為血管管壁或增厚、或管腔狹窄，甚者出現動脈管壁的脂質透明樣變、纖維素樣壞死。

表1 各組各個時間段血壓值比較(mmHg)

注：與生理組，假手術組比較，**P<0.01。

表2 各組每個時間段血壓值比較(mmHg)

注：與生理組，假手術組比較，**P<0.01。

圖1 各組大鼠腦部的組織形態(HE×40)

注：A.生理組；B.假手術組；C.升溫組出血點；D.升溫組出血灶；E.升溫組出血合并空囊；F.降溫組出血點；G.降溫組出血灶；H.降溫組空囊

2.3 氣溫驟降

2.3.1 氣溫驟降刺激后大鼠的整體狀態、血壓變化(見表2) 生理組、假手術組和RHRSP模型組大鼠在溫度調至5 ℃之前的Bp均值分別是：(104.00±3.00) mmHg、(104.78±3.28) mmHg、(206.64±20.08) mmHg。氣溫驟降的刺激結束后模型組大鼠的Bp值升高，而另外2組大鼠無明顯變化。將人工氣候模擬箱的溫度設置成5 ℃后的半個小時觀察大鼠一般狀況發現：各組大鼠均表現為飲水減少、寒顫、蜷縮成團甚至兩兩相擁。如受到外界刺激，也會處于假亢奮狀態，之后仍蜷臥一角，呈瑟瑟發抖狀。

2.3.2 卒中情況 成功復制各組大鼠模型后45 d，給與它們相同條件的驟然降溫刺激。降溫刺激結束后RHRSP模型組大鼠腦出血發生率65%。經過TTC染色沒有發現梗死的大鼠。

2.3.3 病理改變(見圖1) 正常組大鼠的腦組織與氣溫驟升組一樣無明顯改變。出血的腦組織在光鏡下觀察表現為：腦內局部小動脈硬化，具體有血管管壁增厚、某些血管管腔變窄。此次出血的腦組織大多呈現的是小的、散在出血點，有些腦組織出血水腫、或具有空泡的軟化灶，更有甚者出現大片出血灶，空囊形成。

3 討論

3.1 造模方法的特點 此造模方法是在黃如訓[9]教授“雙腎雙夾”模型基礎上進行改進，與其他高血壓大鼠模型[11-15]相比較具有以下特點：1)通過下腔靜脈和腹主動脈尋找腎動脈，不完全暴露腎臟，不會對腎臟牽掣反轉而造成腎臟損傷。2)采用體表定位的方法，使得腹部手術開口比傳統方法小。3)不完全暴露腎臟，可以腹腔感染的幾率，避免由于腸組織回放順序紊亂出現腸梗阻，減少手術后并發癥、病死率的發生。4)采用對血管傷害性較少的棉球及玻璃分針擦拭、分離結締組織，可以減少附近血管及相關臟器的損傷。故該方法造模模型成功率高。

3.2 高血壓與腦卒中 高血壓病(EH)是腦卒中的重要危險因素之一。有研究發現，腦中風的發生率隨血壓的增高而增加。高血壓是腦卒中的重要獨立危險因素，這己被醫學界所公認。[16]血壓可以作為出血性腦卒中預后的預測因素之一。鑒于此，本研究擬選取卒中型腎性高血壓大鼠(RHRSP)作為研究氣溫驟升、驟降誘發腦卒中的動物模型。

3.3 氣溫突變誘發腦卒中 本研究發現：RHRSP(氣溫驟降)大鼠在模型成功復制4周Bp均值就達到(188.25±26.10) mmHg,造模6周Bp穩定在200 mmHg左右。氣溫驟降刺激后腦出血發生率高達65%，較另2組大鼠腦卒中發生率明顯增高。這次實驗研究的結果與以往文獻所報導的冬季發生腦出血較多相一致。與此同時，本研究亦表明，腦卒中的大鼠均發生皮質、髓質的損傷，肢體出現偏癱，Longa≥2分。而在氣溫驟升的刺激下，RHRSP大鼠的腦卒中發生率為45%，與前期文獻報道相符。除此之外，氣溫驟升不僅可誘發腦梗死，也可誘發出血。在臨床研究中發現，在高溫狀態下，人體汗腺分泌增多，使具有腦血管基礎病的患者的血容量減少，血液黏稠，管腔狹窄，易于阻塞，更易導致腦梗死的急性發作。

腦卒中的發生最主要的病變基礎責之于腦血管病變。長期寒冷刺激可導致腦內局部血管壁發生纖維樣壞死、脂質透明變性，甚至小動脈瘤或、夾層動脈瘤形成。一旦遭遇血壓驟然升高，血液滲出或動脈瘤破裂，血液就破入室形成血腫。另一方面，突遇外界冷空氣強刺激后，遠端血管發生痙攣，血管出現缺氧、壞死，局部出血、血栓形成，血液大片融合[17]。

本研究表明，氣溫驟變是腦卒中發生的誘因，氣溫驟升導致RHRSP發生腦梗死的幾率稍高，而氣溫驟降導致該模型大鼠腦出血發病率稍高。但究竟是什么機理還不清楚，還需要進一步研究。

[1]Klimaszewska K，Kulak W，Jankowiak B.Seasonal variation in ischaemic stroke frequency in Podlaskie Province by season[J].AdvMed Sci，2007，52(Suppl 1):112-114.

[2]孫德娟，邱碧秀，毛鐵英.腦卒中的季節性發病及預防[J].黑龍江醫藥，2007，20(3)：281.

[3]朱宏勛,曹銳,胡文忠,等.季節對北京地區急性腦梗塞患者中醫癥候的影響[J].中華中醫藥雜志,2011，26(9):2114-2116.

[4]劉詩英,張昆南,俞慧強,等.在不同氣溫條件下高血壓病患者發生腦梗死的急性期血壓與近期預后的關系[J].實用醫學雜志,2011，27(22):4040-4043.

[5]王巖，祝茗，郭春妮，等.應用圓分布結合候溫法分析上海地區季節變化與急性取血2卒中發病分布規律[J].中風與神經疾病雜志,2013，30(2):124-127.

[6]晉守博，石卉，沈進.腦卒中與氣候因素關系研究[J].重慶工商大學學報：自然科學版,2013，30(3):83-87.

[7]項正兵，張昆南,屈新輝,等.南昌市腦血管病發病與氣象因素相關性研究[J].江西醫藥,2013，48(4):283-285.

[8]殷冬琴.氣象因素對腦卒中發病率影響的灰色關聯分析[J].甘肅聯合大學學報：自然科學版,2013，27(4):18-21.

[9]曾進勝，黃如訓.易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型及其應用[J].中山醫科大學學報，1996，17(4):241-244.

[10]施曉耕,林健雯,黃如訓.人工寒潮誘發腎血管性高血壓大鼠腦卒中[J].實用預防醫學,2007，14(4):976-978.

[11]楊小慢,陸德琴,李賢,等.雙腎雙夾大鼠腎血管性高血壓模型的制作[J].心腦血管病防治,2009，9(5):341-346.

[12]王文靖,潘毅,楊濤.兩腎一夾型高血壓大鼠模型的改良及評價[J].中國實驗方劑學雜志,2012，18(1):203-205.

[13]張奇,呂圭源,夏超群,等.長期高嘌呤飲食誘導高血壓動物模型[J].中藥藥理與臨床,2013，29(1):159-162.

[14]黃國輝,馮建芳,石召鋒,等.腎血管性高血壓大鼠模型復制方法[J].河南科技大學學報,2011，29(4):247-249.

[15]曹珊珊,李瑞芳,方偉,等.腎性高血壓大鼠模型制作的改良方法[J].河南科技大學學報：醫學版,2012，28(3):165-167.

[16]高紅華.急性腦卒中與初次血壓水平[J].中外健康文摘·醫藥學刊，2007，4(12):3.

[17]王維治，羅祖名.神經病學[M].4版.北京:人民衛生出版社，2001:143-148.

(2014-03-10收稿 責任編輯：徐穎)

Effect of Abrupt Climate Change on the Incidence of Cerebral Stroke in Rats

Li Lihua1, Liu Xiaoyan2, Guo Xiazhen2, Yang Yunshuang3

(1ShunyiDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Beijing101300,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 3ArtilleryHospital,TraditionalChineseMedicineDepartment,Beijing100088,China)

Objective:To explore how to improve the model of RHRSP, and the effect of abrupt climate change on the incidence of cerebral stroke in rats. Methods: Body surface location method was used to locate the double renal arteries without exposing the kidney. “RHRSP” rat model was made and then put into an artificial climate simulation box, the incidence of the stroke was observed when the temperature was increased or decreased abruptly. Results: The improved model making method caused low death rate, quick blood pressure rise and high stroke rate. The blood pressure was stabilized to between 220 and 230mmHg after the model was made for around 45d in the sharp temperature rise group, and 205-220mmHg in the sharp temperature drop group; the blood pressure values were statistically significant(P<0.05) in the model group, physiology group and sham-operation group. Sudden temperature change affected the incident rate of cerebral infarction and cerebral hemorrhage in RHRSP. Conclusion: Body surface location method can decrease complication in rats and death rate as well as increasing the incidence rate of cerebral stroke in rats. Blood pressure elevation and abrupt climate change are important inducements to cause cerebrovascular disease; sudden temperature change can cause two different Results: there is high incidence of cerebral infarction in RHRSP when the temperature rises sharply and high incidence of intracerebral hemorrhage when the temperature drops suddenly.

Abrupt climate change; Cerebral stroke; RHRSP

北京市自然科學基金項目(編號：7072038)

李立華(1983—)，女，博士研究生，導師郭霞珍，研究方向：“四時五臟陰陽”理論及實驗研究，E-mail:lihuibear@126.com,地址：北京中醫藥大學56信箱，郵編：100029

劉曉燕(1971—)，女，博士，副主任醫師，研究方向：“四時五臟陰陽”理論及實驗研究”，E-mail:Liuxy1088@sina.com

R226

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.027