白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸生物利用度研究

管詠梅 劉紅寧 楊 明 陳振華 陳麗華 張 妮

(江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌，330004)

白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸生物利用度研究

管詠梅 劉紅寧 楊 明 陳振華 陳麗華 張 妮

(江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌，330004)

目的：研究白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸的生物利用度。方法：分別單劑量口服給藥白頭翁總皂苷和白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸(200 mg/kg)，采用LC-MS法測定大鼠血藥濃度，根據大鼠體內血藥濃度經時過程,計算相應的藥代動力學參數。結果：白頭翁總皂苷和白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸AUC分別為574.82和1776.32 μg/(L·h)。結論：白頭翁總皂苷制成羥丙基-β-環糊精包合物微丸后生物利用度顯著提高。

白頭翁總皂苷；包合物；微丸；生物利用度

白頭翁功擅清熱解毒、涼血止痢，尤善清大腸濕熱及血分熱毒。現代藥理研究結果證實，白頭翁提取物具有良好的抗潰瘍性結腸炎作用[1-2]，將其制成口服結腸靶向微丸有利于藥物集中在病灶部位釋放，改變傳統白頭翁湯劑灌腸給藥的不便。

但白頭翁總皂苷水中溶解度低[3]，直接制成微丸后藥物難以釋放，生物利用度低。課題組前期研究表明，將白頭翁總皂苷制備成羥丙基-β-環糊精包合物結腸靶向微丸能夠促進藥物在結腸部位的釋放[4]。我們通過LC-MS測定其體內血藥濃度，以研究制成羥丙基-β-環糊精包合物微丸后的生物利用度變化情況。

1 材料與儀器

1.1 試藥 常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷對照品(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號：20111108)；白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸(自制)；色譜乙腈(國藥集團化學試劑有限公司)；蒸餾水(實驗室自制)。

1.2 儀器 TG328A型分析天平(德國Sartoius公司)；3-18K型高速冷凍離心機(德國SIGMA公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；BF-2000型氮氣吹干儀(八方世紀科技有限公司)；6410型三重四級桿液質聯用儀(美國安捷倫科技有限公司)。

2 方法

2.1 血藥濃度LC/MS測定方法的建立

2.1.1 色譜及質譜條件 色譜柱：Kinetex C18柱(100 mm×3.00 mm；2.6 μm；廣州菲羅門有限公司)；柱溫：30 ℃；流動相組成：見表1，其中A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。流速：0.4 mL/mL；進樣量：20 μL。

表1 LC/MS流動相組成

質譜檢測條件：采用正離子電噴霧離子化(ESI)方式；選擇性離子監測(SIM)：指標成分常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷m/z：935.4[M+Na]+、內標人參皂苷Re m/z：969.4[M+Na]+；傳輸電壓：135V；干燥氣流速：10 L/mL；霧化壓力：40psi；干燥氣溫度：350 ℃；Dwell：200。

2.1.2 對照品溶液和內標溶液的配制 1)指標成分對照品溶液的配制：取常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷對照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成對照品儲備液。將該儲備液稀釋適當倍數，制成不同溶度的對照品溶液。2)內標物溶液的配制：取人參皂苷Re對照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，再稀釋適當倍數，制成內標物溶液。

2.1.3 血漿樣品處理方法 取0.1 mL空白大鼠血漿3份，分別加入指標成分對照品溶液和內標物溶液各0.02 mL，渦旋振蕩2 min，加乙腈0.3 mL，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣加入0.3 mL乙腈同法再處理1次，合并上清液，于60 ℃水浴氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇振蕩溶解，16 000 r/min離心20 min，取上清液得加藥血漿樣品。取空白大鼠血漿不加對照品溶液，同法處理，得空白血漿樣品，分別進樣分析，記錄色譜圖。

2.1.4 方法的專屬性研究 在上述提取條件及色譜、質譜條件下，測定空白血漿、指標成分與內標物混合對照品、加藥血漿及給藥后血漿樣品的LC-MS色譜圖。

2.1.5 標準曲線的制備及最低檢測限 取0.1 mL大鼠空白血漿，分別精密加入不同濃度的指標成分對照品溶液0.02 mL和1 000 ng/mL內標物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法處理樣品，每種濃度3份樣品，記錄指標成分的提取離子流峰面積As與內標物的提取離子流峰面積Ais。以指標成分的提取離子流峰面積As與內標物的提取離子流峰面積Ais的比值R(As/Ais)對血樣中指標成分對照品濃度C(ng·mL-1)作線性回歸，考察線性范圍并求得標準曲線方程。當信噪比(S/N)等于3時的血樣濃度為最低檢測限。

2.1.6 精密度 取0.1 mL大鼠空白血漿，分別精密加入高、中、低三種濃度的指標成分對照品溶液0.02 mL和1 000 ng/mL內標物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法處理樣品。記錄指標成分的提取離子流峰面積As與內標物的提取離子流峰面積Ais，將比值(As/Ais)代入標準曲線方程，計算測得濃度，考察日內和日間精密度。

2.1.7 回收率 取0.1 mL大鼠空白血漿，分別精密加入高、中、低三種濃度的指標成分對照品溶液和1 000 ng/mL內標物溶液各0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法處理樣品，每種濃度平行做3份樣品。記錄指標成分的提取離子流峰面積As與內標物的提取離子流峰面積Ais。取與血樣濃度相等的指標成分對照品溶液分別進樣分析，記錄提取離子流峰面積A。將比值(As/Ais)代入標準曲線方程，計算測得濃度，計算絕對回收率和方法回收率。

2.1.8 穩定性試驗 取0.1 mL大鼠空白血漿，分別精密加入高、中、低3種濃度的指標成分對照品溶液，每種濃度平行3份。置于-20 ℃冰箱存放，分別于4 d和7 d后于37 ℃復融，按上述乙腈沉淀蛋白法處理樣品并測定濃度。

2.2 白頭翁總皂苷指標成分含量測定方法 SD大鼠隨機分為兩組，每組平行6只。實驗前禁食不禁水24 h。按組別分別灌胃200 mg/kg白頭翁總皂苷提取物和白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物微丸。分別于給藥0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h后采集血樣，立即置于肝素化試管中，4 000 r/mim離心10 min。取0.1 mL血漿，加入1 000 ng/mL內標物溶液0.02 mL，渦旋振蕩2 min，加乙腈0.3 mL，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣加入0.3 mL乙腈同法再處理1次，合并上清液，于60 ℃水浴氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇振蕩溶解，16 000 r/min離心20 min，取上清液進樣分析，記錄指標成分及內標物的提取離子流峰面積，計算其血藥濃度。

2.3 數據處理方法 將各時間點血藥濃度用DAS2.0藥動學軟件模擬，以AIC值為擬合度指標，在權重為1、1/C、1/C2條件下判斷房室模型，并計算藥動學參數。

3 結果

3.1 方法專屬性 采用乙腈沉淀蛋白法，按照2.1.1中色譜及質譜條件，測得空白血漿、指標成分與內標物混合對照品、加藥血漿及給藥后血漿樣品的LC-MS色譜圖。

圖1 LC/MS色譜圖

由圖1可見，指標成分常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷保留時間約為6.8 min，內標人參皂苷Re保留時間約為1.5 min。血漿中內源性物質及其他成分均不干擾指標成分及內標的色譜峰。

3.2 標準曲線和最低檢測限 大鼠空白血漿中精密加入不同濃度的指標成分對照品溶液0.02 mL，制成濃度分別為2.14，10.68，21.36，106.8，213.72，534.32，1068.6 ng/mL的含藥血樣，分別加入1 000 ng/mL內標物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法處理樣品并進樣分析，記錄峰面積，以血漿中的指標成分和內標物的峰面積比值R(As/Ais)為橫坐標，血樣濃度C為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程見圖2。當S/N為3時，用本法測得血漿中最低檢測限為0.5 ng/mL。

圖2 血漿HPLC-MS標準曲線

3.3 精密度研究結果 低、中、高三種不同濃度的含藥血樣于同一天不同時間測定5次，并每日測定1次，連續測定5 d，分別計算的日內精密度高中低濃度RSD分別為4.8%、7.2%、6.3%，日間精密度高中低濃度RSD分別為12.1%、9.4%、13.5%，表明樣品日內日間精密度良好。

表2 精密度試驗結果

3.4 回收率研究結果 低、中、高三種不同濃度的含藥血樣的絕對回收率和方法回收率見表3。實驗結果表明，回收率可滿足體內樣品分析方法的要求。

表3 回收率試驗結果

3.5 穩定性研究結果 低、中、高3種不同濃度的含藥血樣于-20 ℃冰箱分別存放4 d和7 d后測定濃度，結果表明指標成分在大鼠血漿中穩定性較好。

3.6 數據處理結果 實驗測得白頭翁總皂苷原藥和包衣微丸的血藥濃度和藥時曲線分別見表5、表6和圖3。

表4 穩定性試驗結果

表5 白頭翁總皂苷提取物口服給藥后血藥濃度(ng/mL)

表6 白頭翁總皂苷微丸口服給藥后血藥濃度(ng/mL)

將血藥濃度輸入計算機，用DAS2.0藥代動力學軟件進行模擬，以AIC值作為擬合效果優劣的判斷標準。結果表明，白頭翁總皂苷原藥和包衣微丸在大鼠體內的藥動學過程均符合一室模型，權重為1/C2擬合比較合適。擬合的藥動學參數分別見表7和表8。

結果可見，白頭翁總皂苷羥丙基-β環糊精包合微丸口服給藥后Tmax、Cmax、MRT與白頭翁總皂苷相比均發生了顯著改變，其中AUC分別為574.82和1776.32 μg/(L·h)，說明包合物包衣微丸口服給藥后達峰時間和體內滯留時間延長，最大血藥濃度降低，表現出一定的結腸靶向效應，而且將白頭翁總皂苷制成羥丙基-β-環糊精包合物后再制成結腸靶向微丸，其大鼠體內生物利用度顯著提高。

圖3 口服給藥后藥時曲線

4 討論

研究者在實驗中分別采用乙腈沉淀蛋白法、甲醇沉淀蛋白法和乙酸乙酯萃取法處理大鼠血漿樣品，結果發現乙腈沉淀蛋白法消除血漿中基質干擾的效果最好。

藥物制成結腸靶向制劑后由于其在胃及小腸中釋放量減少，生物利用度往往會下降[5]，而本文制備的結腸靶向微丸的生物利用度相比原藥卻有顯著提高。其原因可能是本文中的結腸靶向微丸主要在回腸末端及結腸部位釋藥，根據本課題組對白頭翁總皂苷提取物離體腸吸收行為的研究，其在小腸各部位與結腸部位的吸收無統計學意義，因此藥物在回腸末端和結腸釋放后均有一定程度的吸收。此外，本文中的微丸是以白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物為原料制備而成，包合物能夠增加藥物成分的溶出及吸收，從而提高其生物利用度。

[1]張文遠，韓盛璽，楊紅.白頭翁醇提物對葡聚糖硫酸鈉誘導大鼠結腸炎肥大細胞致炎作用的抑制研究[J].西部醫學，2005，17(2)：99-101.

[2]張文遠，韓盛璽，楊紅.白頭翁醇提物對葡聚糖硫酸鈉誘導大鼠結腸炎的抗炎作用機制研究[J].中華消化雜志，2004，24(9)：568-570.

[3]陳振華，管詠梅，張妮，等.白頭翁總皂苷溶解性能考察[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(13)：28-30.

[4]陳振華，管詠梅，朱衛豐，等.白頭翁總皂苷-羥丙基-β-環糊精包合物結腸靶向微丸生物利用度研究[J].中國中藥雜志，2013，38(24)：4292-4297.

[5]程剛，肖云彩，吳壽榮，等.新型茶堿口服結腸靶向給藥系統的體內動力學[J].沈陽藥科大學學報，2003，20(1)：1-4.

表7 白頭翁總皂苷提取物口服給藥的藥動學參數

表8 白頭翁總皂苷包衣微丸口服給藥的藥動學參數

(2015-02-02收稿 責任編輯：洪志強)

Study on the Bioavailability of Pulsatilla Total Saponins-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion Clathrate Pellets

Guan Yongmei, Liu Hongning, Yang Ming，Chen Zhenhua, Chen Lihua, Zhang Ni

(KeyLaboratoryforModernPreparationofTraditionalChineseMedicineunderMinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Objective:To explore the bioavailability of Pulsatilla total saponins- hydroxypropyl -β- cyclodextrin clathrate pellets. Methods: The total Saponin of Pulsatilla Chinensis Regel and its OH-β-CD clathrate Pellets (200 mg/kg) were administered in rats respectively, the plasma levels were determined by LC-MS. Then the corresponding pharmacokinetic parameters based on the time process of blood drug concentration were calculated. Results: AUC of the Total Saponin of Pulsatilla Chinensis Regel and its OH-β-CD inclusion complex were 574.82 and 1776.32μg/L·h. Conclusion: The bioavailability of pulsatilla total saponins can be improved significantly by the technology of hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion.

Pulsatilla total saponins; Inclusion; Pellet；Bioavailability

科技部十二五國家重大新藥創制科技重大專項(編號：013ZX09103-002-001)；江西省自然科學基金項目(編號：20122BAB215041)；江西省教育廳科技落地計劃項目(編號：贛財教[2011]243號)

管詠梅(1979—)，女，河南人，副教授，碩士研究生導師，研究方向：中藥新劑型、新技術，聯系電話：(0791)87118614，E-mail：guanym2008@163.com

楊明，男，教授，博士生導師，研究方向：中藥新劑型、新技術、新輔料、新設備，聯系電話：(0791)87118718，E-mail：yangming16@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.008