赤芍藥化學成分及抗腫瘤活性研究進展※

王鳳紅 王 麗 侯慧卿 王亞珍

(河北省血液中心供血科，河北 石家莊 050071)

赤芍藥為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.veitchiiLynch的干燥根。多年生草本，主要分布于四川、云南、貴州、山西、西藏、甘肅等地。以其干燥根入藥，味苦，微寒，歸肝、脾經。具有清熱涼血、散瘀止痛、斂陰止汗的功效。不同炮制方法藥性有所不同。炒赤芍藥性緩和，可用于瘀滯疼痛;酒赤芍藥則活血散瘀力強。赤芍藥很早已有藥用記載，臨床用于溫毒發斑、吐血衄血、目赤腫痛、肝郁脅痛、經閉痛經、癥瘕腹痛、跌仆損傷及癰腫瘡瘍等［1］。

已有文獻對赤芍藥化學成分的研究主要有兩部分:赤芍總苷(TPG)和赤芍 801(propyl gallate)。TPG系赤芍藥的主要活性部位，主要有效成分包括芍藥苷(3.1% ～7.0%)、芍藥內酯苷(0.1%)、羥基芍藥苷(0.06%)、苯甲酰芍藥苷(0.01%)等單萜苷類化合物［2］。傳統的制備方法為赤芍藥飲片用一定濃度的醇水回流提取即可得到。TPG藥理活性眾多，如抗凝血、抗血栓、改善微循環、對心腦腎缺血性損傷的保護作用、對肝損傷的保護、抗抑郁及抗腫瘤等［3］。赤芍 801是由赤芍藥的活性成分沒食子酸經酯化反應合成的沒食子酸丙酯，其分子結構中含有多個酚羥基，具有較強的抗氧化作用，赤芍801的注射劑(通用名注射用棓丙酯)已在臨床上用于預防和治療腦梗死、冠心病及血栓性靜脈炎等疾病。研究表明，赤芍801除具有強抗氧化作用外，尚有抗自由基、抗炎、阻斷脂氧酶活性、抗血小板聚集、刺激血小板顆粒釋放及改變血小板膜組成等多種藥理活性［4］。

現代藥理學研究表明，赤芍藥有保肝、抗血栓形成、抗血小板聚集、降血糖、抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤等多種藥理作用［5］。其化學成分主要有單萜苷類、三萜類、鞣質類、芳香酸類及兒茶素類等。赤芍藥化學成分多樣，但明確的活性成分報道較少，抗腫瘤作用的研究也未見系統報道。現將近年來赤芍藥化學成分及抗腫瘤活性研究進展綜述如下。

1 赤芍藥的化學成分

芍藥中主要化學成分以單萜及單萜苷類化合物為主，結構骨架為具有籠狀蒎烷結構或內酯結構的單萜及單萜苷類。芍藥屬植物大都含芍藥苷，也是其代表性成分，根中含量1.8% ～7.3%，主要集中在根皮部分;葉中含量1% ～1.1%。1963年Shibata等從芍藥中首次分離得到芍藥苷［6］，其高度氧化的籠狀蒎烷骨架及獨特的橋頭氧－β－葡萄糖結構引起了人們極大興趣，后陸續從芍藥及同屬植物中得到多個芍藥苷類化合物，如羥基芍藥苷［7］、4－ 乙基－ 芍藥苷［8－9］、芍藥 內 酯 苷［10－11］、苯 甲 酰 芍 藥苷［12］、沒食子酰芍藥苷［10，13］、沒食子酰氧化芍藥苷［12］，Alessandra B 等［14］報道了異芍藥苷、異苯甲酰芍藥苷［12］。芍藥新苷與常見的芍藥苷類不同，蒎烷結構高度氧化變形［15］。此外，還有單萜及單萜苷類如:京尼平苷［16］，芍藥內酯 A、B、C，lactinolide，6－O－β－D－glucopyranosyllactinolide［8］等。

三萜類及甾類報道的種類較多，甾類如胡蘿卜甾醇［10］、β－ 谷甾醇［8］;三萜類包括四環三萜palbinone［10］，木栓烷型三萜木栓酮、表木栓醇［11］，齊墩果烷型三萜 11α，12α－ epoxy－3β，23－dihydroxyolean－ 28，13β－ olide［17］、hederagenin［10］、齊 墩 果酸［18］，羽扇豆烷型三萜白樺酯酸［17］等。

已分離得到的黃酮及其苷類包括d－兒茶素［7］、(2R，3R)－4－methoxyl－ distylin［7］、Kaempferol－3－O－ β－D－glucose［17］，花青素類如芍藥花苷［10］等，酚酸類［10］如沒食子酸、丹皮酚、丹皮酚苷等，Pedunculagin［10］及 Eugeniin 均為苯丙素的多聚體。

此外，從赤芍藥中分離得到的還有環烯醚萜類、鞣質、酸類、酯類、酮類、揮發油、糖、氨基酸、蛋白質、脂肪油、樹脂、黏液質、生物堿、色素及微量元素等。

2 抗腫瘤活性

2.1 抗腫瘤作用 TPG的抗腫瘤作用先后已有不少報道。陳志偉等［19］實驗發現TPG對S180肉瘤小鼠的抑瘤率為40%;腫瘤細胞和核膜出現皺縮、斷裂，線粒體出現腫脹和空泡樣改變，顯示TPG對腫瘤細胞有直接殺傷作用。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定TPG對S180及K562腫瘤組織的抑瘤作用，結果顯示TPG對 K562作用最好，濃度為50 μg/mL時起作用，抑制率達45.9%［20］。潘正剛［21］研究赤芍藥對骨腫瘤作用時發現，赤芍藥對小鼠S180移植腫瘤亦具有明顯抑制作用。吳楊崢［2］對芍藥苷、4－氧－甲基芍藥苷單體進行了體外抗腫瘤活性篩查，用芍藥苷干預人口腔表皮樣癌KB細胞和人肺癌 A549細胞的增殖，發現在1～100 μmol/L范圍內能有效抑制KB細胞增殖。

2.2 誘導腫瘤細胞凋亡 細胞凋亡是一種特殊的細胞死亡方式，是胞內發生的多步驟的主動自殺過程。細胞凋亡信號傳導的大致過程是細胞整合各種胞內外凋亡信號，通過細胞凋亡信號與其受體形成的復合物經細胞質信號轉導蛋白傳遞至一組細胞凋亡的執行者 caspase，再由激活的caspase對其特異性底物進行降解，最終導致細胞凋亡［22］。

TPG促腫瘤細胞凋亡相關基因研究主要集中在Bcl－2家族、c－myc及少數抑癌因子。Bcl－2家族是一組與美麗線蟲抗凋亡基因CED－9同源的蛋白，哺乳動物中Bcl－2家族目前已發現了十幾個成員。Bcl－2可與Bcl－2 家族的 Bcl－Xl、Bcl－Xs、Bax、Bcl－2、Bad 和 Mcl－l形成同源或異源的蛋白二聚體，而特定的蛋白二聚體則可作為在細胞死亡信號通路上的分子開關，在細胞凋亡過程中起雙重調節作用［23－24］。P16、P21、P27、P53 作為抑癌基因，是細胞周期重要調控因子［25］。原癌基因 c－myc屬慢反應即刻早期應答基因，參與細胞增殖和凋亡調控［26］。

已有研究表明TPG在多劑量下均明顯抑制HepA肝癌小鼠腫瘤的生長，抑制腫瘤細胞G0/G1期比例，向S期細胞轉化，凋亡率增高;下調腫瘤細胞中Bcl－2蛋白的表達，明顯提高腫瘤細胞中Bax蛋白的表達。表明TPG可以通過影響Bcl－2和Bax的表達來促進腫瘤細胞凋亡［27］。另外，對荷瘤小鼠給予TPG后，測定Bcl－2、P16及 c－myc mRNA表達，結果顯示實驗組與模型組 Bcl－2、c－myc陽性表達差異顯著，提示 TPG作用機制與c－myc表達有關，進而調節Bcl－2，促進 P16 的表達［26］。

王亞珍等［28］在TPG抑制人黑色素瘤A375細胞增殖方面做了系列研究，多個濃度對黑色素瘤細胞均具有明顯的增殖抑制作用。100 mg/L TPG作用黑色素瘤細胞48 h，增殖細胞核抗原(PCNA)mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著下降，而 P21、P27、P53的mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著上升。TPG聯合卡鉑作用于黑色素瘤細胞后，PCNA和cyclin D1 mRNA及蛋白水平較卡鉑單獨作用組下降更為明顯;P21 mRNA及蛋白水平較卡鉑單獨作用組升高更加顯著。因此，TPG和卡鉑聯合用藥效果更優，可進一步提高藥物對腫瘤細胞的生長抑制［29］。Cyclin D也是細胞周期調節因子之一，其過度表達是多種人類原發性腫瘤特征。

2.3 免疫調節效應 機體的免疫功能與腫瘤的發生、發展存在密切關系。植物抗腫瘤有效成分能提高機體免疫監視系統，包括巨噬細胞 (MΦ)、殺傷性T細胞(CTL)、T細胞、自然殺傷細胞(NK)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、白細胞介素 (IL)和其他細胞因子的活性來達到殺傷腫瘤細胞的目的。

CD4+T細胞分為Th1細胞和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IL－2、腫瘤壞死因子 β(TNF－β)、干擾素－ γ(IFN－ γ)，參與CTL介導的細胞免疫，在抗腫瘤和抗胞內感染中發揮作用;Th2細胞主要分泌 IL－4、IL－5、IL－6、IL－10，可刺激 B 細胞增殖，促進抗體產生，參與體液免疫，在抗細胞外感染及致敏原引起的免疫應答中起主要作用。Th1和Th2細胞彼此交叉調節，相互抑制，以維持機體在生理上的平衡［30］。機體的抗腫瘤作用是以Th1介導的細胞免疫為主，而大多數腫瘤患者體內常表現為Th2型細胞因子占優勢，發生 Th1/Th2漂移。CD8 T細胞是另一類重要的淋巴細胞，在抗病毒和抗腫瘤中起重要作用。CD8+T細胞通過Ca2+/穿孔素依賴性機制介導細胞毒作用;CD8+T細胞活化可刺激IFN－γ、淋巴毒素(LT)的產生，促進MФ活化，同時使細胞膜上的FcR(免疫球蛋白Fc部分c末端的受體)表達增加，從而使抗體依賴性巨噬細胞的細胞毒作用增加，發揮抗腫瘤效應。實驗表明，荷瘤組CD8+分子與正常組比較顯著降低，CD4+/CD8+增加，使機體處于免疫紊亂狀態。

對S180肉瘤小鼠及S180移植骨腫瘤小鼠實施TPG干預后，實驗組脾臟均明顯增大，提示TPG抑制荷瘤生長與機體的免疫功能有關［19］。TPG 對荷瘤鼠免疫功能調控的實驗顯示，TPG使荷瘤鼠的胸腺指數和脾指數都增加，能降低IL－10和TGF－β1分泌，增加 IL－12 分泌［31］。TPG還能提高FIN－γ的分泌，維持Th1的優勢狀態，從而發揮抗腫瘤效應。增強CDs分子的表達，糾正CD4+/CDs+比值失衡，恢復機體正常免疫功能［32］。實驗中Th1型和Th2型細胞免疫反應都有所增強，提示細胞免疫應答和體液免疫應答均可能參與了對腫瘤損傷過程［33］。于曉紅等［25］也觀察了TPG對荷瘤小鼠免疫功能的調節及對腫瘤細胞凋亡的調控作用，得到了類似結果。此外，TPG能明顯促進P16上調，抑制腫瘤的發生。環磷酰胺聯用TPG能逆轉腫瘤抗原和環磷酰胺引起的T淋巴細胞免疫抑制和免疫紊亂。

2.4 抑制血管內皮細胞 丁罡等［10］從腫瘤血管的角度探討了赤芍藥與腫瘤轉移的關系，Walk－er256癌脾內移植肝轉移大鼠模型經中藥灌胃后，檢測血管內皮細胞生長因子 (VEGF)的變化和腫瘤微血管密度的變化，結果表明，大鼠血清VEGF濃度在予中藥灌胃后明顯升高，腫瘤組織微血管密度及VEGF表達均高于對照組。該結果提示:赤芍藥能增強實驗大鼠VEGF的表達及腫瘤血管的形成，并可促進腫瘤侵襲和轉移的發生，有別于上述結論。Deng H 等［34］報道了 TPG(12.5、62.5、312.5 μg/mL)對血管內皮細胞增殖呈現明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。TPG作用黑色素瘤細胞后，VEGF和促血管生成素－2(Ang－2)的mRNA及蛋白水平均明顯下降，表明TPG可通過抑制VEGF和Ang－2的表達發揮抗腫瘤作用［35］。

2.5 其他效應 MMP－2和MMP－9是MMPs家族(為一類高度保守的鋅離子依賴內肽酶家族)中最主要的酶，在腫瘤的血管化、腫瘤細胞的侵襲和轉移灶形成過程中起重要作用，在多種惡性腫瘤中均有高表達，且與臨床分期、病理分級及淋巴結轉移有關。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP－2)、多耐藥基因1(MDR1)、凋亡抑制因子(Survivin)、TOP2A(Topoisomerase Ⅱalpha，編碼 DNA拓撲異構酶Ⅱα)、多藥耐藥相關蛋白 1(MRP1)等是與多藥耐藥相關的因子或蛋白。王亞珍等［36］在研究TPG抑制黑色素瘤A375細胞的遷移和侵襲中發現，與對照組比較，TPG組細胞 MMP－2、MMP－9 mRNA和蛋白表達明顯下降，TIMP－2 mRNA和蛋白表達顯著上升。王亞珍等［37］考察TPG對多藥耐藥因子影響時發現，TPG 處理組 MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1的 mRNA及蛋白表達均顯著降低 (P＜0.01)。TPG可能通過下調多藥耐藥因子MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1 mRNA及蛋白表達，逆轉黑色素瘤的多藥耐藥，提高化療敏感性。

線粒體膜電位反映線粒體的功能狀態，線粒體膜通道開放可導致線粒體通透性的改變。胞內Ca2+升高參與了凋亡早期信號傳導和凋亡的執行階段，Ca2+穩態的破壞可直接引起線粒體釋放細胞色素C和一些促細胞凋亡因子，從而激活 caspases家族啟動細胞凋亡程序。許惠玉等［38］報道在TPG誘導K562凋亡的過程中，不同濃度檢測的細胞內Ca2+出現不同程度的升高。推測可能是細胞內鈣穩態失衡，胞漿內Ca2+作為第二信使啟動多條信號轉導途徑，誘導K562細胞凋亡。

黃孔威等［39］對赤芍藥的抗腫瘤作用進行了系列研究，赤芍藥水提物、70%乙醇提取物、正丁醇萃取物 (赤芍藥70%乙醇提取物減壓濃縮，正丁醇萃取，減壓抽干得6%不定形粉末)顯示了不同程度的抑制腫瘤增殖的活性，均能提高癌細胞內或癌組織中cAMP的水平，提示赤芍藥的抗癌作用可能與其影響腫瘤細胞內環磷酸腺苷(cAMP)的含量有關。

3 小結

赤芍藥或其組方用于癰腫瘡瘍的治療已有幾千年的歷史，現已發現赤芍藥中含多種成分，其中TPG被公認是赤芍藥的活性部位，其體內、體外抗腫瘤作用明確，已引起眾多學者的關注。TPG中代表成分為具有蒎烷結構的芍藥苷類，很有可能成為潛在的抗腫瘤先導化合物。但還存在很多問題，如抗腫瘤作用機制缺乏系統研究，已報道的抗細胞增殖的活性大多為TPG的作用，究竟是其中的哪些單體活性較強，或者具有哪些獨特作用機制還未可知。此外，TPG促腫瘤細胞凋亡相關基因研究主要集中在Bcl－2家族、c－myc、少數抑癌因子P，其他一些蛋白酶和激酶在細胞凋亡的調控中也起著重要作用，還有待于進一步深入研究。

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