灰霉菌脅迫下水楊酸對擬南芥抗氧化酶的影響

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灰霉菌脅迫下水楊酸對擬南芥抗氧化酶的影響

劉 云 鵬，伍琳，王靜*

(包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014030)

摘要：本研究用100umol/L的水楊酸對擬南芥幼苗進(jìn)行預(yù)處理，24h后用6×105個/mL的孢子懸液侵染擬南芥幼苗，測定灰霉菌侵染后擬南芥幼苗內(nèi)SOD，POD，CAT活性，MDA的含量，旨在探討外源SA對擬南芥抵抗灰霉菌脅迫的影響，為進(jìn)一步深入研究植物抗逆誘導(dǎo)劑及抗逆分子機(jī)理提供有利幫助。

關(guān)鍵詞：水楊酸；灰霉菌；抗氧化酶；擬南芥

灰霉菌(Botrytiscinerea)，屬半知菌亞門真菌，寄生的植物超過200種[1]。灰霉孢子可寄生在擬南芥葉片上，其菌絲可穿透葉片表皮細(xì)胞，侵入到葉片內(nèi)吸收寄主營養(yǎng)。水楊酸(salicylic acid, SA)，即鄰羥基苯甲酸, 是一種簡單的酚類化合物, 在植物體內(nèi)作為內(nèi)源信號分子參與多種代謝的調(diào)節(jié)[2]，是一種新型的植物激素。水楊酸在植物抗逆生理中發(fā)揮著重要作用，它能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來提高植物對逆境脅迫(如冷、熱、鹽、干旱、重金屬等)的抵抗能力[3]。

1材料與方法

1.1　灰霉菌的培養(yǎng)

本實驗用土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)灰霉菌[4]。將接好菌的培養(yǎng)管于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，23℃培養(yǎng)15d，每隔5d拍一次照。

1.2　擬南芥的分裝及噴施水楊酸

將生長16天的擬南芥分裝成對照組和噴水楊酸組(每組分為2、4、6、8天四個小組，每小組設(shè)不進(jìn)行脅迫的對照)，選擇兩個不同的地點，分別對其噴施蒸餾水和100umol/L的水楊酸。噴施后，將擬南芥放回植物培養(yǎng)架上繼續(xù)培養(yǎng)24h[5]。

1.3　灰霉菌侵染實驗

(1)將漏斗(漏口塞住脫脂棉)，玻璃棒，移液槍槍頭，錐形瓶(100mL)于121℃，0.103MPa下滅菌20min。

(2)取三支長有灰霉菌的試管，向第一支試管中加入2mL無菌水，將玻璃棒灼燒，貼壁冷卻后，刮掉培養(yǎng)基斜面上的菌絲和孢子，使孢子充分懸浮到水中。

(3)將懸液倒入另外一支灰霉菌試管中，加入1mL無菌水，重復(fù)以上操作，第三支也同上。

(4)把漏斗插入錐形瓶中，堵住出口的脫脂棉用無菌水浸潤，將第三支試管內(nèi)的孢子懸液倒入其中，使孢子懸液過濾至錐形瓶中，用封口膜將錐形瓶的口密封。

(5)用血球計數(shù)板在相差顯微鏡下對孢子進(jìn)行計數(shù)。

(6)用無菌水將其稀釋成600個孢子/uL的懸液。

(7)用0.5-10uL的移液槍分別吸取5uL灰霉菌孢子懸液于預(yù)處理24h后的擬南芥的第一片真葉上。

1.4　SOD,POD,CAT活性的測定

稱取0.5g葉片，用液氮研磨，倒入10mL的離心管中，加入62.5mmol/l，PH7.8的磷酸緩沖液5mL，分裝于2ml EP管中于CT14RD型離心機(jī)1000 r/min，4℃下離心20 min，上清液即為酶提取液。

SOD活性的測定測定方法參見劉祖祺和張石城(1994)[6]。酶反應(yīng)體系加樣順序：62.5mmol/L，PH=7.8的磷酸緩沖液2.4mL，0.06mmol/L的核黃素0.2mL，30mmol/L的蛋氨酸0.2mL，0.003mmol/L的EDTA 0.1mL，待測酶液20uL，1.125mmol/L的氮藍(lán)四唑(NBT)0.2mL。以不加待測酶液(用PBS替代)的管為最大光還原管，不加NBT(用PBS替代)的管為空白對照，每組重復(fù)四次，然后于4000lux下反應(yīng)25min，反應(yīng)液在波長為560nm處測其吸光值(用空白對照調(diào)零)，以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活單位(U)。

SOD活性(U/gFW/min)=(ACK-AE)×V/0.5×ACK×W×Vt×t

(ACK為最大光還原管的吸光度；AE為測定管的吸光度；V為酶液的總體積，mL；Vt為測定時酶液的用量，mL；W為葉片鮮重，g；t為反應(yīng)時間，min)。

POD活性的測定 測定方法參見袁朝興和丁靜(1990)[7]。反應(yīng)系統(tǒng)：4.0mL愈創(chuàng)木酚溶液，100uL待測酶液和400uL 30%的H2O2。加入H2O21min后比色(波長470nm)，對照以PBS(PH=6.0)代替酶液，每組重復(fù)四次，每分鐘OD470增加0.01為一個酶活性單位(U)。

POD活性(U/gFW/min)=△A470×VT/W×Vs×0.01×t

(△A470為反應(yīng)時間內(nèi)OD470的變化；VT為酶液總體積，mL；Vs為測定時酶液的用量，mL；W為葉片鮮重，g；t為反應(yīng)時間，min)。

CAT活性的測定測定方法參見李柏林和梅慧生(1989)[8]。5mL反應(yīng)液為PBS 50mmol/L，H2O28mmol/L以及100uL待測酶液。以PBS(PH=7.0)代替酶液作空白對照，30℃下反應(yīng)1min，加2mL 10%的H2SO4終止反應(yīng)，每組重復(fù)四次。用2mmol/L KMnO4滴定剩余的H2O2，根據(jù)H2O2的消失量計算CAT活性。

CAT活性(umol/gFW/min)=(VCK-VE)×5×50/W

(VCK為空白對照所消耗KMnO4溶液的體積，mL；VE為各測定組所消耗KMnO4溶液的體積，mL；W為葉片鮮重，g)。

1.5　丙二醛含量的測定

測定方法參見劉祖祺和張石城(1994)[9]。取離心所得上清液2mL于具塞試管中，加入2ml PBS(62.5mmol/L，PH=7.8)，4mL 10%的三氯乙酸(含0.5%的硫代巴比妥酸)，混勻，蓋蓋兒，煮沸15min，快速冷卻，4000r/min離心(4℃)20min，用10%的三氯乙酸溶液為對照，上清液于450nm、532nm、600nm處測其OD值。

MDA(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56 OD450

求出提取液中MDA的濃度，根據(jù)葉片鮮重計算MDA在幼苗中的含量(umol/g)。

2結(jié)果與分析

2.1　SOD活性的測定結(jié)果

如圖1所示，灰霉菌脅迫前4天，擬南芥幼苗的SOD活性逐漸增加，在第4天時達(dá)到最高，之后逐漸下降。灰霉菌脅迫下，噴SA組擬南芥幼苗的SOD活性均高于噴水對照的，第2天，噴SA組幼苗SOD的活性比噴水對照高61.81%，差異極顯著；第6天，噴SA組幼苗SOD的活性比噴水對照高10.99%，差異顯著。

圖1:擬南芥幼苗在灰霉菌脅迫下體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的變化

由圖2可以看出，灰霉菌脅迫前6天，擬南芥幼苗的POD活性逐漸增加，到第6天時達(dá)到最高值，之后隨著脅迫時間的延長而下降。

灰霉菌脅迫下，噴SA組擬南芥幼苗的POD活性均高于噴水對照的，第2天，噴SA組擬南芥幼苗的POD活性比噴水的對照高30.67%，差異顯著(P<0.05)；第6天，噴SA組幼苗的POD活性比噴水對照高26.67%，差異極顯著(P<0.01)。

圖2:擬南芥幼苗在灰霉菌脅迫下體內(nèi)過氧化物酶活性的變化

2.3　CAT活性的測定結(jié)果

由圖3可以看出，擬南芥幼苗的CAT對灰霉菌脅迫響應(yīng)很快，第2天CAT活性即達(dá)到峰值，之后逐漸下降。

灰霉菌脅迫下，噴SA組幼苗的CAT活性高于噴水對照。第2天，噴SA組幼苗的CAT活性比噴水對照高70.8%，差異極顯著(P<0.01)。

圖3:擬南芥幼苗灰霉菌脅迫下體內(nèi)過氧化氫酶活性的變化

2.4　MDA含量的測定結(jié)果

由圖4中可以看出，灰霉菌脅迫下，MDA含量逐漸增加，未經(jīng)脅迫的擬南芥幼苗MDA的含量基本保持穩(wěn)定。

灰霉菌脅迫下，經(jīng)水楊酸預(yù)處理的擬南芥幼苗體內(nèi)MDA的含量比噴水對照的低。

圖4:灰霉菌脅迫下擬南芥幼苗中丙二醛含量的變化

3結(jié)論

灰霉菌脅迫下，噴SA組擬南芥幼苗中三種酶的活性均高于噴水對照，丙二醛的含量均低于噴水對照，說明水楊酸能通過誘導(dǎo)擬南芥幼苗抗氧化酶活性的提高來增強(qiáng)其抵抗灰霉菌脅迫的能力，緩解灰霉菌脅迫對植株帶來的傷害。

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Effect of Salicylic Acid on Several Antioxidant Enzymes of Arabidopsis Thaliana under Botrytis Cinerea Stress

LIU Yun-peng, WU Lin, WANG Jing

(Faculty of Biology and Biotechnology, Baotou Teachers College, Baotou 014030)

Abstract:In this study, Arabidopsis seedlings were pretreated with 100umol / L salicylic acid.After 24 hours, we used solution of botrytis cinerea to infect the Arabidopsis seedlings.Then we determined the activity of SOD, POD, CAT seedlings and the contents of MDA in Arabidopsis.We did this in order to investigate the effect of SA on Arabidopsis seedlings under botrytis cinerea stress and make a progress on plant defense inducers and molecular Mechanisms of resilience.

Key words:Salicylic acid; Botrytis cinerea; Antioxidant Enzyme; Arabidopsis thaliana

中圖分類號：Q945.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-1869(2015)02-0022-04

作者簡介：劉云鵬(1988-)，內(nèi)蒙古武川縣人，碩士研究生，研究方向：抗逆分子生物學(xué)。

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)基金面上項目(2010MS0522)。

收稿日期：2014-11-04