小鼠骨髓間充質干細胞SCA-1+／CD45+／CD31+亞群自身抗凋亡基因研究

賀繼剛，李洪榮，桂龍升，李永武，嚴 丹，王 平

小鼠骨髓間充質干細胞SCA-1+／CD45+／CD31+亞群自身抗凋亡基因研究

賀繼剛，李洪榮，桂龍升，李永武，嚴 丹，王 平

目的探討小鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）亞群SCA-1+／CD45+／CD31+抗凋亡的分子基礎。方法以小鼠心臟干細胞表面分化抗原檢測BMSCs后以CD45、CD31為標準分選得到4個亞群。體外將4個亞群采用無血清低氧（5%）培養，流式細胞術檢測各組的凋亡率。分別將細胞注入心梗48 h小鼠體內于注射后48 h完成心功能測定?？梢奡CA-1+／CD45+／CD31+組抗凋亡能力最強，心臟彩超提示心功能恢復亦優于其他各組。采用基因芯片完成Agilent小鼠全基因4×44K芯片從分子水平對SCA-1+／CD45+／CD31+亞群抗凋亡能力進行探討。結果將SCA-1+／CD45+／CD31+與其他組有關于凋亡基因進行聚類分析及Network結果共同比較可見兩者無交集，以上述差異基因4倍表達為標準，因而以Network結果為主?？梢奛FkB1、RB1、E2F1為感興趣基因。結論小鼠BMSCs為一多克隆的細胞群體。SCA-1+／CD45+／CD31+抗凋亡及改善心功能方面優于其他亞群；其分子機制在于NFkB1、RB1、E2F1基因表達較其他亞組多見。

小鼠骨髓間充質干細胞；亞群；基因

心臟干／祖細胞（cardiac stem／progenitor cells，CSCs／CPCs）在心肌中含量很少，約占1%，有多個亞群，目前報道為6個亞群［1］，包括側群細胞、干細胞抗原-1（stem cell antigen-1，SCA-1）陽性祖細胞、胰島素樣受體-1（islet 1，ISL-1）陽性祖細胞、特異表面抗原-1（stage-specific embryonic antigen-1，SSEA-1）陽性祖細胞、c-KIT陽性祖細胞和心肌球來源的祖細胞。本實驗擬通過采用CSCs 6個亞群分化抗原為標志，對小鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）進行分選。結果以CD45及CD31為標準可以篩選得到4組小鼠BMSCs亞群SCA-1+／45+／31-、SCA-1+／45-／31+、SCA-1+／45-／31-、SCA-1+／45+／31+。將各亞群采用無血清、低氧（5%）培養，流式細胞術檢測各組凋亡率。再分別將細胞注入心梗模型建模48 h小鼠體內于細胞注射后48 h行心梗模型小鼠心功能測定。研究［2］顯示SCA-1+／CD45+／CD31+亞組細胞抗凋亡能力最強，注射SCA-1+／CD45+／CD31+亞組細胞的心梗模型小鼠心功能改善亦優于其它各亞組。要回答以上現象僅僅靠細胞表面分化抗原是遠遠不夠的。該研究采用基因芯片技術完成Agilent小鼠全基因4×44K芯片從分子水平對上述問題答案進行了探討。

1 材料與方法

1.1 小鼠BMSCs的培養全骨髓培養小鼠（C57BL／6）BMSCs，胰酶消化傳代至第3代時采用CD11b的磁珠負選，去除造血干祖細胞。繼續傳代至第7代。

1.2 小鼠BMSCs亞群的分選采用6種小鼠心肌干細胞亞群表面分化抗原，利用流式細胞術按照前述操作對小鼠BMSCs進行篩查可得SSEA-1-PE（1.1%）、ISL-1-PE（0.8%）、CD31-PC7（48.0%）、CD45-PE（30.7%）和c-KIT-FITC（1.6%）。而后按CD31及CD45兩個分化抗原的陰性及陽性檢測結果，利用磁珠將BMSCs分為4個亞群，分別為SCA-1+／CD45-／CD31-、SCA-1+／CD45-／CD31+、SCA-1+／CD45+／CD31-和SCA-1+／CD45+／CD31+細胞亞群。

1.3 主要試劑和儀器基因雜交試劑盒（Agilent technologies）、單標熒光RNA試劑盒（Agilent technologies）、無RNA酶的DNA酶試劑盒（Agilent technologies）、雜交爐（Agilent technologies Santa Clara）、安捷倫微陣列掃描儀（Agilent technologies Santa Clara）。

1.4 方法將各亞群及未分選群細胞體外采用低氧（5%）、無血清培養（C57BL／6小鼠BMSCs培養基，美國Cyagen Biosciences公司），流式細胞術檢測各亞群及未分選群的凋亡率。并將各亞群及未分選群注入心梗48 h小鼠體內48 h后行心臟彩超。

1.4.1 基因芯片檢測 所用芯片為Agilent小鼠全基因4×44K芯片（design ID：014868），共有4個標本，需要完成4張上述芯片。

1.4.2 樣品RNA的放大和標記 實驗樣品RNA采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒，單色熒光標記低輸入快速放標記試劑盒（Cat＃5190-2305，美國Santa Clara公司）和標準操作流程對樣品總RNA中的mRNA進行放大和標記，并用微型RNA酶試劑盒（Cat＃74106，德國公司QIAGEN公司）純化標記好的cRNA。樣品RNA質檢方法：安捷倫2100生物分析。樣品RNA質控標準：RIN≥7.0和28S／18S＞0.7。

1.4.3 芯片雜交 按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中以65℃、10 r／min滾動雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為基因表達洗滌液試劑盒。

1.4.4 結果掃描 完成雜交的芯片采用安捷倫微陣列掃描儀進行掃描，軟件設置染料通道：綠色，掃描分辨率＝5 μm，PMT 100%，10%，16位。用特征提取軟件10.7讀取數據，最后采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.5 數據分析

1.5.1 聚類分析 檢測樣本為小鼠BMSCs 4組亞群。分別為SCA-1+／45+／31-、SCA-1+／45-／31+、SCA-1+／45-／31-、SCA-1+／45+／31+4個亞組，將其行Agilent mRNA芯片檢測，獲得數據。對原始數據采用均一化、去背景并設置一定標準，篩選差異基因，行GO、pathway及網絡分析。對調節細胞凋亡的基因構建聚類圖。

1.5.2 基因網絡分析 同時整合3種相互作用關系：①KEGG數據庫中基因調控、基因表達蛋白間的相互作用、蛋白修飾等關系；②通過已有高通量實驗，如已被酵母雙雜交實驗等證實蛋白-蛋白相互作用；③通過KEGG數據庫中提到的基因之間相互作用。下載KEGG數據庫中pathway數據，通過R（http：／／www.r-project.org／）下的KEGGSOAP（http：／／www.bioconductor.org／packages／2.4／bioc／html／KEGGSOAP.html）軟件包，分析基因組范圍內基因之間相互作用。

蛋白與蛋白之間的相互作用數據自MIPS數據庫下載（http：／／mips.helmholtz-muenchen.de／proj／ppi／）。將從KEGG數據庫中篩選出的基因采用cocitation算法，下載PubMed數據庫中的文獻摘要，將摘要分解為句子，分析每個句子中存在的共同基因名稱，即co-citation基因。并將每對co-citation基因，統計出此基因出現的頻率。而當基因對出現頻率越高，則表明基因間互相作用可能性越大。如將PubMed數據庫中文獻的總數記作N，基因對中的兩個基因在PubMed數據庫中獨立出現的頻率，分別記作m，n。假設實際中基因對中的兩個基因同時出現次數為k，利用超幾何分布，就可以算出完全隨機條件下出現大于k次co-citation概率：

其中

最后通過綜合考慮以上3種數據結果，將其整合為基因間的相互關系網絡。該網絡通過medusa軟件進行圖形展示。

1.6 統計學處理采用SPSS 15.0軟件進行分析，數據以表示。各細胞亞群間比較采用單因素方差分析，統計假設檢驗均為雙側。

2 結果

2.1 BMSCs各亞群抗凋亡能力體外SCA-1+／CD45+／CD31-、SCA-1+／CD45-／CD31-、SCA-1+／CD45+／CD31+、SCA-1+／CD45-／CD31+及未分選組采用低氧（5%）、無血清培養并采用流式細胞術檢測各組的凋亡率。比較SCA-1+／CD45+／CD31+亞群與其余各亞群及未分選群的凋亡率，上述實驗共進行4次，將4次結果進行統計；SCA-1+／CD45-／CD31-、SCA-1+／CD45-／CD31+、SCA-1+／CD45+／CD31-、SCA-1+／CD45+／CD31+及未分選組的凋亡率分別為（48.26±21.18）%、（45.36±24.19）%、（46.06±17.82）%、（16.49±6.46）%、（44.48± 17.25）%。表明SCA-1+／CD45+／CD31+抗凋亡能力優于其他亞群及未分選群，差異有統計學意義（F＝6.34，P＜0.05）。見表1。

2.2 BMSCs各亞群對心肌梗死小鼠心功能的影響

各亞群及未分選群采用DIR標記，注入18只心梗48 h后小鼠體內。于注射后48 h檢測小鼠心功能。比較SCA-1+／CD45+／CD31+亞群與其余各亞群及未分選群改善心功能的情況。與SCA-1+／CD45+／CD31-、SCA-1+／CD45-／CD31-、SCA-1+／CD45-／CD31+及未分選組比較，SCA-1+／CD45+／CD31+的左室射血分數（EF%）、左室環比收縮（FS%）較其他亞組及未分選組均有明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組干細胞注射48 h左室舒張末期直徑（LVIDd）及左室收縮末期容積（LVIDs）變化幅度基本相同。見表2。

2.3 小鼠BMSCs各亞群抗凋亡相關基因比較

以SCA-1+／CD45+／CD31+細胞為主，挑選其與其他3組間存在差異基因的表達，做聚類分析，可見Park2、Prkcb、Frzb、Dmpk基因較其他組表達明顯降低。Lcn2、Egr3、Pik3r3、Mdrn4、Cul7、Fcerlg、Map3kg基因較其他組表達明顯增高。見圖1。基因網絡分析SCA-1+／CD45+／CD31+細胞在抗凋亡方面與其他組差異基因的表達網絡圖及直方圖見圖2，從圖中可見NFKB1、RB1、E2F1、HIF1A、IFNG、ATM、EGFR、KR1T1、EP300、TLR4連接度較高，表達較其他基因多，認為是一些關鍵基因。

將SCA-1+／CD45+／CD31+與其他組的抗凋亡基因的聚類分析及Network結果共同比較可見兩者無交集，對4個組分別做兩兩比較。如果某個基因在任何兩組間存在4倍變化（取對數后的倍數變化值為2），則認為該基因存在差異表達?？梢奛FkB1、RB1、E2F1為引起SCA-1+／CD45+／CD31+抗凋亡的關鍵基因。

3 討論

DNA芯片（也稱為基因芯片或生物芯片）是DNA附著在固體表面點的集合。來源于Southern印跡，其原理就是將已知基因片段或序列固定到固體表面，而后采用探針標記及雜交的方法對需要測定的序列或片段進行檢測［3］。實驗通過采用以上原理完成了小鼠Agilent全基因4×44K基因芯片，從分子水平對小鼠BMSCs 4個亞群生物學差異進行探討。以SCA-1+／CD45+／CD31+亞群細胞為主，對表達基因中涉及到有關抗凋亡的基因將表達量最低及最高的基因行聚類分析可見SCA-1+／CD45+／CD31+亞組細胞表達的Prkcb、Park2、Dmpk、Frzb基因較其它亞組表達明顯降低。而Pik3r3、Lcn2、Egr3、Mdrn4、Map3kg、Cul7、Fcerlg基因則較其它亞組表達明顯增高。Network分析是指以基因間的關系作為分析單位，在指定的基因群中，尋找彼此的關聯，進而將基因鏈接成一個網絡，而在這個指定的基因群中，如果其表達的越多，則其連接度就越高。將SCA-1+／CD45+／CD31+亞組與其它亞組抗凋亡基因進行聚類及Network分析，比較兩種分析的結果可見兩個結果并無交集，對4個亞組做兩兩比較。如果某個基因在任何兩組間的表達出現4倍變化（取對數后倍數變化值為2），可以考慮此基因表達存在差異。固通過Network結果提示：RB1、NFkB1、E2F1基因是引起SCA-1+／CD45+／CD31+亞組抗凋亡能力優于其它亞組抗凋亡能力的關鍵基因。

表1 低氧、無血清環境下各亞群及未分選群培養24 h凋亡率（%）

表2 心梗48 h注射BMSCs后48 h心臟彩超檢測心功能差值（）

表2 心梗48 h注射BMSCs后48 h心臟彩超檢測心功能差值（）

與同一指標其余組比較：*P＜0.05

指標SCA-1+／CD45-／CD31-SCA-1+／CD45-／CD31+SCA-1+／CD45+／CD31-SCA-1+／CD45+／CD31+未分選未注射干細胞F值EF%32.810±5.78029.580±4.32029.870±1.65035.780±4.470*12.780±2.7400.600±0.0705.424 FS%22.770±4.37021.630±3.84023.870±3.78025.340±3.320*7.760±1.2400.300±0.0045.455 LVIDd（mm）-1.160±0.090-1.180±0.070-1.170±0.560-1.150±0.6201.020±0.4300.070±0.0031.008 LVIDs（mm）-0.690±0.002-1.650±0.003-1.350±0.760-0.580±0.0301.010±0.0200.080±0.0091.386

NF-κBP（核因子105）是由NF-κB1基因編碼蛋白質［4］。該基因主要編碼一個105 ku的蛋白質，通過蛋白酶26S加工翻譯進一步產生50 ku蛋白質。蛋白質105 ku是特定的蛋白轉錄酶抑制劑，蛋白50 ku是NF-κB蛋白復合物結合亞基。NF-κB是一種轉錄因子，可以通過氧化自由基、細胞內、外各種刺激因子如紫外線、細胞因子、病毒或細菌的產物被激活。激活后的NF-κB轉位進入細胞核，參與并刺激多種生物學功能基因表達；已知在不同類型細胞及特定條件下有超過200個基因是NF-κB目標。NF-κB還可以通過抑制凋亡基因的啟動，從而延長細胞生命［5］。

視網膜母細胞瘤蛋白（RB1）［6］是腫瘤抑制蛋白，其在多種癌細胞上功能是缺失的。RB1主要的一項功能是通過抑制細胞生長周期，從而阻止細胞過度生長，直至細胞準備分裂。其還可以激活染色體重塑酶，如乙?；讣凹谆?，完成細胞的重塑。RB1屬于口袋型蛋白質家族，其家族成員有一個共同的口袋狀結合位點用于和其它蛋白質相連［7］。如高危型人乳頭狀瘤病毒感染后的細胞可以產生出致癌蛋白，通過滅活及綁定RB1，導致細胞過度增生，產生癌癥。RB1基因也可通過減弱p53基因功能而發揮重要抗凋亡作用。RB1的高表達促進了細胞抗凋亡能力。

轉錄因子E2F1是由人E2F1基因編碼蛋白［8］。此基因編碼的蛋白質是E2F家族成員中的一種轉錄因子。E2F家族成員在抑制細胞生長周期和抑制促癌蛋白激活中，發揮著非常重要的作用，同時其也是小DNA腫瘤病毒蛋白質轉化目標。E2F蛋白所包含的多數家庭成員都可以發現幾個進化上高度保守域。包含DNA結合域，此區域決定調控分化的轉錄因子（DP）的分化，此結構域富含腫瘤抑制蛋白關聯域及酸性氨基酸。而腫瘤抑制蛋白關聯域是嵌入轉錄域中的。此蛋白和另外兩種成員（E2F3及E2F2）都擁有一個調節細胞生長周期的蛋白質結合域。在調節細胞生長周期中優先與PRB蛋白相互結合。其通過介導細胞生長增殖并減弱非依賴及依賴p53基因所介導的細胞凋亡，從而發揮抗凋亡的作用［9］。

綜上所述，小鼠BMSCs為一多克隆的細胞群體。SCA-1+／CD45+／CD31+抗凋亡方面優于其他亞群。其分子機制在于NFkB1、RB1、E2F1基因表達較其他亞組多見。

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Genetic research of mouse bone marrow mesenchymal stem cells subsets SCA-1+／CD45+／CD31+itself anti-apoptotic ability

He Jigang，Li Hongrong，Gui Longsheng，et al
（Dept of Cardiovascular，First People＇s Hospital of Yunnan Province，Kunming 650032）

ObjectiveTo investigate the molecular basis of the anti-apoptosis effects of the SCA-1+／CD45+／CD31+subset of mice bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）.MethodsAfter the mice cardiac stem cell surface differentiation antigen was used to detect the BMSCs，four subsets were obtained，with CD45，CD31 as the sorting standard.These four groups were grown in vitro in serum-free cultures under hypoxia（5%）.The apoptosis rate of each group was measured by flow cytometry.The cell cultures were injected into mice with 48 h myocardial infarction to determine the cardiac function after another 48 h.Among the four groups，the SCA-1+／CD45+／CD31+subset demonstrated the highest anti-apoptotic effect.Color sonography showed that the recovery of cardiac function in the SCA-1+／CD45+／CD31+subset was relatively better than that in the other groups.An agilent whole mice genome 4×44K chip was used to study the anti-apoptosis effects of the SCA-1+／CD45+／CD31+subset at the molecular level.ResultsClustering analysis and network of the apoptosis genes was performed on the SCA-1+／CD45+／CD31+subset against the other subsets.Resultsof network and Clustering analysis showed the absence of an intersection between groups.A fourfold difference in the expression of the above mentioned genes were set as the standard for differential expression based on the networkResults.NFkB1，RB1，and E2F1 were identified as the genes of interest.ConclusionBMSCs belong to a polyclonal cell population.The SCA-1+／CD45+／CD31+subset is relatively better than the other subsets in terms of its anti-apoptosis effects and improvement in cardiac function.The molecular mechanism of SCA-1+／CD45+／CD31+activity may involve NFkB1，RB1，and E2F1 because the expression is more common in the SCA-1+／CD45+／CD31+subset than in the other subsets.

BMSCs；subgroup；gene

R 654.2

A

1000-1492（2015）12-1757-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.022.html

2015-09-30接收

國家自然科學基金（編號：81460073）；云南省科技廳-昆

明醫科大學應用基礎研究聯合專項（編號：2014FB089）作者單位：云南省第一人民醫院心臟大血管外科，昆明 650032

賀繼剛，男，博士，碩士生導師；

王 平，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：jiganghe999＠163.com