雪蓮中綠原酸、蘆丁、木犀草素含量的HPLC法測定

張海霞 盧永昌 王庶

摘要：建立測定雪蓮（Saussurea involucrata）中綠原酸、蘆丁和木犀草素含量的方法，采用HPLC法，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.8%磷酸水溶液進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫30 ℃。綠原酸、蘆丁、木犀草素的線性范圍分別為0.081～0.408 μg/mL、0.090～0.449 μg/mL、0.045～0.224 μg/mL;平均加樣回收率分別為99.78%、99.89%、100.70%，其中綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高，木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高。

關鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;雪蓮（Saussurea involucrata）;綠原酸;蘆丁;木犀草素

中圖分類號：R284.2;S567 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0434-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.045

Determing Chlorogenic Acid， Rutin and Luteolin in Saussurea Involucrate of Three Varieties with HPLC

ZHANG Hai-xia1，LU Yong-chang2，WANG Shu1

（1.College of Life Science and Chemistry，Qinghai University for Nationalities， Xining 810007， China;

2.Key Laboratory of Chemical， Qinghai-Tibet Plateau Plants Resources，Xining 810007， China）

Abstract： To establish a method for determining chlorogenic acid， rutin and luteolin in Saussurea involucrate， the Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm， 5μm） column was used. The mobile phase was consisted of acetonitrile and 0.8% aqueous phosphoric acid with gradient elution.The flow rate was 1. 0 ml·min-1 and the detective wavelength was 360 nm. The column temperature was 30℃. The peak areas and concentrations of chlorogenic acid， rutin and luteolin had good correlation in the ranges of 0.081～0.408μg/mL，0.090～0.449μg/mL and 0. 0448～ 0.224μg/mL， with the average recovery rates of 99.78%，99.89% and 100.70%， respectively. The contents of chlorogenic acid and rutin were the highest in Saussurea involucrata（Kar. et Kir.） Sch.-Bip. Saussurea obov-allata （DC.） Edgew had the maximum content of luteolin.

Key words：HPLC; Saussurea involucrata （Kar. et Kir.） Sch.-Bip.; chlorogenic acid; rutin; luteolin

雪蓮（Saussurea involucrata）又名雪荷花，為菊科（Asteraceae）鳳毛菊屬（Saussurea）植物，珍稀名貴中藥材，常見的有苞葉雪蓮、水母雪蓮、天山雪蓮、唐古特雪蓮等，主要分布在2 400 m以上的高原寒帶地區的青海、新疆、甘肅、四川、西藏等地。雪蓮性溫、微苦，祛風除濕，通筋活血，暖宮散瘀效果顯著。此外，對風濕性疾病具有特殊效果，還具有抗炎鎮痛、止血消腫之功效，使用安全，無明顯的不良反應[1-3]。藥理研究顯示蘆丁、木犀草素和綠原酸為雪蓮中的主要抗腫瘤抗癌有效成分[4-6]。對于蘆丁、木犀草素和綠原酸在雪蓮中的含量同時分析測定尚未見報道。為有效控制雪蓮藥材質量，本試驗采用微波提取法對雪蓮中蘆丁、木犀草素和綠原酸進行提取，采用高效液相色譜法對蘆丁、木犀草素和綠原酸的含量進行了測定，并比較了不同種雪蓮藥材3種物質的含量差異。該方法快速、簡便、準確、重復性好，為雪蓮藥材的進一步研究和綜合開發利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

雪蓮系2012年8月采自青海、新疆（經高原生物研究所胡鳳祖副研究員鑒定）。

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1311A四元輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329A自動進樣器，G1315A二級管陣列（DAD）檢測器，Agilent1200色譜工作站。

1.2 ?試驗試劑

蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）、綠原酸標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-200212）和木犀草素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111520-200504）;乙腈，甲醇為色譜純，磷酸為分析純;水為超純水。

1.3 ?色譜條件

色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）; 流動相乙腈（A）-0.8% 磷酸水溶液（B） ，梯度洗脫（0～8 min，10%～15% A;8～12 min，15%～30%A;12～35 min，30%～32% A）;檢測波長360 nm;流速為1.0 mL/min;進樣10 μL，柱溫30 ℃。

1.4 ?溶液的配制

1.4.1 ?標準品溶液制備 ?分別精密稱取綠原酸 10.20 mg、蘆丁 11.23 mg、木犀草素5.60 mg，置于 50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質量濃度分別為204.0、224.6、112.0 mg/L的標準品儲備液。

1.4.2 ?供試品溶液的制備 ?精密稱取雪蓮藥材粉末1.30 g，置具塞錐形瓶中，精密加入純甲醇40 mL，超聲波處理2 h，冷卻，再稱定重量，用純甲醇補足減失重量，0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2 ?結果與分析

2.1 ?系統適應性試驗

分別吸取標準品溶液和供試品溶液，按“1.3”的色譜條件，分別進樣10 μL，記錄色譜圖。結果表明在此色譜條件下，綠原酸、蘆丁、木犀草素分離良好，分離度均大于1.5，且理論塔板數均不低于4 000，結果見圖1至圖4。

2.2 ?線性關系考察

精密吸取上述標準品儲備液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，配成系列質量濃度的標準品溶液。取10 μL進樣后記錄峰面積，以質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），以峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得到綠原酸、蘆丁、木犀草素的回歸方程。

綠原酸：Y=12 316X+99.5（r=0.999 9）

蘆丁：Y=11 276X+246.5（r=0.999 7）

木犀草素：Y=22 277X+20.8（r=0.999 5）

結果表明，綠原酸、蘆丁、木犀草素分別在0.081～0.408、0.090～0.449、0.045～0.224 μg/mL與峰面積線性關系良好。

2.3 ?穩定性試驗

用自動進樣器依次對同一供試品溶液進樣，在1、 2、3 d后分別進樣10 μL，以峰面積計算。結果表明，綠原酸的RSD為1.23%，蘆丁的RSD為1.35%，木犀草素的RSD為1.30%，供試品溶液在3 d內穩定。

2.4 ?精密度試驗

按“1.3”的色譜條件，綠原酸，蘆丁和木犀草素的標準品溶液各進10 μL，每種溶液測定6次，記錄峰面積，綠原酸RSD為0.88%，蘆丁RSD為1.18%，木犀草素RSD為1.22%，表明進樣精密度良好。

2.5 ?重復性試驗

精密稱取水母雪蓮粗粉（過100目）6份，按“1.4.2”制備樣品溶液，用“1.3”的色譜條件，進樣分析，記錄峰面積，綠原酸的RSD為0.89%（n=6），蘆丁的RSD為0.89%（n=6），木犀草素的RSD為1.11%（n=6）。

2.6 ?加樣回收試驗

取已知綠原酸、蘆丁和木犀草素含量的雪蓮9份，分別在上述9份藥材中加入綠原酸的標準品溶液（0.204 mg/mL）、蘆丁標準品溶液（0.225 mg/mL）和木犀草素標準品溶液（0.112 mg/mL），按“1.4.2”制得供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄雪蓮中綠原酸、蘆丁和木犀草素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結果見表1。

2.6 ?樣品測定

按“1.3”的色譜條件，分別精密稱取3種雪蓮藥材粉末各1 g，按上述方法測得綠原酸質量分數為0.132 1%～0.193 3%，平均為0.160 7%（n=8）;蘆丁質量分數為0.113 4%～0.202 2%，平均為0.171 2%（n=8）;木犀草素質量分數為0.020 4%～0.058 2%，平均為0.036 1（n=8），其中綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高，木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高（表2）。

3 ?小結與討論

雪蓮中所含成分復雜，其理化性質相差較大，表現出較大的色譜行為差異。目前文獻報道的多組分含量測定方法不甚理想，多有拖尾現象。考慮到綠原酸與蘆丁2組分均具酸性，筆者通過調節流動相的pH，以抑制樣品組分的解離，較好地改善了峰形[7]。同時，三者的極性差異較大，為了使各組分有較好的分離效果，采用梯度洗脫技術[8，9]。先后使用不同比例的甲醇、甲醇-磷酸、乙腈、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等，分離效果均不顯著，分離度不達標，采用乙腈-0.8%磷酸水溶液梯度洗脫后，拖尾情況有較好改善，圖譜特征性增強，目標峰的峰型和分離度均較好，故選擇乙腈-0.8%磷酸水溶液為流動相[6]，用于梯度洗脫。

通過對3種雪蓮樣品中3種藥效化合物的含量進行測定，結果表明，不同種雪蓮有效成分含量有差異：木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高;綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高。可見，品種基因影響了藥材有效成分的積累，根據有效成分的含量確定藥材的品種是非常必要的，為今后雪蓮的開發應用提供了必要的信息。

參考文獻：

[1] 莊 ?麗，李衛紅，孟麗紅.新疆雪蓮資源的利用、研發與保護[J].干旱區資源與環境，2006，20（2）：195-201.

[2] 謝宗波，姜國芳.雪蓮化學成分及藥理作用研究進展[J].食品科技，2010，29（5）：438-440.

[3] 袁曉凡，趙 ?兵，王玉春.雪蓮的研究進展[J].中草藥，2004，35（12）：1424-1426.

[4] 張偉敏，張盛林，鐘 ?耕.木犀草素的研究概況[J].中國食品添加劑，2005，6（2）：11-15.

[5] 陳紹華，王亞琴，羅立新.天然產物綠原酸的研究進展[J].食品科技，2008，4（2）：195-198.

[6] 陳 ?勇，李艷苓，李 ?立，等.HPLC法測定山綠茶不同炮制品種中綠原酸和蘆丁的含量[J].廣西科學院學報，2006，22（4）： 416-418.

[7] 董建輝，華 ?卡.高效液相色譜法同時測定天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量[J].中南藥學，2007，5（4）：333-335.

[8] 劉海芳，魏東偉，劉全軍，等.太行菊不同器官中綠原酸和4種黃酮類物質含量研究[J].天然產物研究與開發，2013（5）：646-651，671.

[9] 劉尤巖，周文芳，王玉忠，等.高效液相色譜法分離測定雪蓮細胞中的黃酮[J].藥物分析雜志，2005，25（l）：40-43.