武陵山羊肚菌液體培養條件優化研究

劉達玉 王慧超 鄭林用 戴玄 李宗堂 陳今朝

摘要：對武陵山羊肚菌（Morchella ?esculenta）的液體培養條件、培養基進行了優化。結果表明，最適液體培養條件為pH 6.0、培養液裝量100 mL/250 mL、接種量8%、溫度25 ℃、搖床轉速180 r/min、培養時間6 d;最適發酵培養基為4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4和0.10% MgSO4·7H2O。在此條件下，菌絲體干重為6.880 g/L，胞外多糖產量為0.861 g/L。

關鍵詞：武陵山羊肚菌（Morchella ?esculenta）;液體培養;菌絲體;胞外多糖

中圖分類號：Q949.32 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0405-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.037

Optimizing of Liquid Culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain

LIU Da-yu1，WANG Hui-chao2，ZHENG Lin-yong3，DAI Xuan2，LI Zong-tang4，CHEN Jin-zhao2

（1.Faculty of Biotechnology Industry，Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.Life Science and Technology Institute， Yangtze Normal University， Chongqing 408100，China; 3.Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066，China;

4.Chengdu Rongzhen Edible Fungi Ltd.， Chengdu 611733，China）

Abstract： The conditions and media of liqiud culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain were optimized. The results showed that the optimal conditions were the pH value of 6.0， the medium capacity of 100 ml/250 ml triangle bottle， the inoculation quantity of 8.0%， the temperature of 25 ℃， the rotation speed of shaking flask of 180 r/min and the time of 6 days. The optimal liquid fermentation media of Morchella esculenta were 4.0% sucrose，0.70% yeast powder，0.15% KH2PO4 and 0.10% MgSO4·7H2O. Under these conditions， the dry weight of the mycelia and the yield of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta were up to 6.880 g/L and 0.861 g/L， respectively.

Key words： Morchella esculenta in Wuling Mountain; liquid culture; mycelium; extracellular polysaccharide

羊肚菌（Morchella esculenta）是一種營養豐富、美味可口的珍貴食藥用菌，其性平、味甘，益腸胃、化痰理氣，補腎、壯陽，補腦、提神，具有增強肌體免疫力、抗疲勞、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制腫瘤等功能[1，2]。雖然國內外已有一些羊肚菌人工栽培的報道，但由于其對氣候、土壤等環境條件要求苛刻，至今仍未實現規模化栽培[3-6]。自然資源很少，遠不能滿足市場需求。為此，筆者分離重慶武陵山羊肚菌，并對其液體培養條件進行了優化，擬為其人工栽培、食品和藥品開發提供依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菌種：武陵山羊肚菌，長江師范學院生物技術實驗室分離保存。

母種PDA培養基：20%馬鈴薯（去皮）煮汁，2.0%葡萄糖，0.30%蛋白胨，1.8%瓊脂，0.10% K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH自然[7]。

液體種子培養基：10%馬鈴薯煮汁，2.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4，pH 6.0[8]。

發酵培養基：4.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH 6.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種活化 ?把保藏的羊肚菌母種轉接到無菌PDA培養基平皿上，25 ℃培養7 d，備用。

1.2.2 ?液體培養方法 ?將種子培養液裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，0.10 MPa、121.3 ℃滅菌20 min，冷卻，接羊肚菌母種于錐形瓶中，160 r/min、25 ℃培養3 d備用[9]。發酵培養液裝量同種子培養液，培養條件相同，培養時間6 d。

1.2.3 ?發酵培養基選擇 ?選取蔗糖、酵母粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O 4個因素，設計L9（34）正交試驗，因素與水平見表1。通過試驗，篩選最佳培養基配方。

1.2.4 ?菌絲體干重測定 ?取發酵液30 mL，在4 000 r/min離心10 min，沉淀菌絲體用去離子水洗滌3次，于70 ℃下烘干至恒重，稱重，每個處理重復3次。

1.2.5 ?羊肚菌胞外多糖測定 ?參照武秋立等[10]的方法，取出菌絲體羊肚菌發酵液加入3倍乙醇于0 ℃下沉淀12 h，于4 000 r/min離心10 min;棄上清液，沉淀加少量乙醇再離心，重復兩次后，將沉淀用去離子水溶解定容，用硫酸-蒽酮法于620 nm處測吸光度，根據硫酸-蒽酮葡萄糖標準曲線計算胞外多糖產量。

1.2.6 ?數據處理 ?試驗數據用DPS 7.05版軟件處理，用LSD法比較菌絲體干重和多糖的差異顯著性。

2 ?結果與分析

2.1 ?液體培養條件選擇

2.1.1 ?pH對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?用2.0 mol/L HCl或氫氧化鈉溶液調節培養液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，接種培養（表2）。當pH 6.0時，菌絲體生長最快，其干重和胞外多糖產量均最高; pH 6.0與pH 7.0菌絲體干重之間差異不顯著，而pH 6.0與pH 5.0胞外多糖產量之間差異極顯著;當pH 4.0時，菌絲體干重及多糖產量均最低。可見，菌絲體生長、多糖形成的最適pH為6.0。

2.1.2 ?培養液裝量對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?250 mL三角瓶分別裝60、80、100、120、140 mL培養液（表3）。當培養液裝量為100 mL時，菌絲體干重、多糖產量均最高;當裝量為140 mL時菌絲體干重、多糖產量均最低。因此，最適裝量為100 mL。

2.1.3 ?接種量對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?培養液接種量分別為4%、8%、12%、16%、20%（表4）。當接種量8%時，菌絲體干重、多糖產量均最高;接種量8%與12%菌絲體干重、多糖產量之間均差異極顯著;接種量20%時，菌絲體干重、多糖產量均最低。可見，最適接種量是8%。

2.1.4 ?溫度對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?培養溫度分別為21、23、25、27、29 ℃（表5）。在25 ℃時，菌絲體干重、多糖產量均最高;在21℃時，菌絲體干重、多糖產量均最低。可見，最適培養溫度是25 ℃。

2.1.5 ?轉速對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?將培養液置于搖床上振蕩培養，轉速分別設置為140、160、180、200、220 r/min（表6）。當轉速為180 r/min時，菌絲體干重最重，180、200 r/min菌絲體干重之間差異顯著;當轉速為200 r/min時，多糖產量最高;而200、180 r/min多糖產量之間差異不顯著。因此，最適轉速為180 r/min。

2.1.6 ?培養時間對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?培養液分別培養4、5、6、7、8 d（表7）。當培養6 d時菌絲體干重最重，培養6 d與7 d菌絲體干重之間差異極顯著;培養8 d時多糖產量最高，培養8 d與7 d多糖產量之間差異不顯著，而培養7 d與6 d多糖產量之間有極顯著差異。因此，最適培養時間為6 d。

2.2 ?發酵培養基選擇

2.2.1 ?碳源對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?分別用4.0%可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和麥芽糖代替發酵培養基中的葡萄糖為碳源（表8）。結果菌絲體干重在蔗糖培養基中最重，在可溶性淀粉培養基中最輕;多糖產量在可溶性淀粉培養基中最高，在麥芽糖培養基中最低。綜合菌絲體干重和多糖產量，選蔗糖為最適碳源。

2.2.2 ?氮源對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?分別用0.50%牛肉膏、酵母粉、硫酸銨和尿素代替發酵培養基中的蛋白胨（表9）。菌絲體干重、多糖產量在酵母粉培養基中均最高，二者在尿素培養基中均最低。因此，酵母粉是最適氮源。

2.2.3 ?無機鹽對菌絲體干重和多糖產量的影響 ?分別用0.10% K2HPO4、CaSO4·0.5H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O代替發酵培養基中的K2HPO4和MgSO4·7H2O（表10）。在只有K2HPO4培養基中菌絲體干重、多糖產量均最高，但在K2HPO4與MgSO4·7H2O培養基中菌絲體干重、多糖產量之間差異不顯著;在ZnSO4·7H2O培養基中菌絲體干重、多糖產量均最低。因此，最適無機鹽是K2HPO4。

2.2.4 ?正交試驗結果 ?由表11可知，以菌絲體為指標的培養基最優配方為A2B3C3D2;以多糖為指標的培養基最優配方為A2C3D3B2;兩者結合并合并主次順序選A2B3C3D2，即4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。但該培養基配方不在正交試驗列表中，用該培養基配方進行驗證試驗，結果菌絲體干重為6.880 g/L，胞外多糖為0.861 g/L。

3 ?小結

武陵山羊肚菌的最適液體培養條件為pH 6.0、250 mL錐形瓶培養液裝量為100 mL、接種量8%、溫度25 ℃、搖床轉速180 r/min，培養時間6 d。最適液體發酵培養基為4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。在此優化條件下，菌絲體干重為6.880 g/L，多糖產量為0.861 g/L，菌絲體干重、胞外多糖產量分別比正交試驗表中的最優配方A2B3C1D2高9.71%和19.09%。

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