羅田甜柿種質資源ISSR分子標記初步鑒定

程華 陳小玲 李琳玲 程軍勇 鄧先珍 張雪花 黃兵杰 程水源

摘要：分別采集湖北省羅田縣、麻城市自然分布的28、8株羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）古樹優系及小澀柿、無核、寶蓋、秋焰甜柿優系為研究材料，利用簡單重復序列間擴增分子標記（Inter simple sequence repeat，ISSR）技術對40個甜柿優系進行初步認證及親緣關系分析。結果表明：①從21條ISSR引物中篩選出了9條能夠擴增出清晰、穩定條帶的引物，9條引物共擴增出185條譜帶，其中多態性條帶有185條，多態性條帶比率為100%;②應用NTSYS2.10e軟件對擴增結果進行非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，40個甜柿優系大致被分為兩大類，遺傳相似系數從0.39到0.92;③羅田甜柿古樹基因資源豐富，每個基因型都有其獨特的指紋圖譜，遺傳多樣性高。羅田甜柿優系間的親緣關系與地理來源有一定的相關性，麻城市與羅田縣地理位置交界區域的羅田甜柿資源相對集中在A區，其他地理位置采集優系集中在B區。分析結果可為羅田甜柿種質資源開發、基因資源保存、后期品種審定及鑒別提供理論依據。

關鍵詞：羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）;簡單重復序列間擴增分子標記;種質資源;鑒定

中圖分類號：S665.2;Q75;S602.4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? 文章編號：0439-8114（2015）02-0370-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2015.02.029

A Preliminary Identification of the Genetic Resources of Luotian Sweet Persimmon

with ISSR Markers

CHENG Hua1，CHEN Xiao-ling1，LI Lin-ling1，CHENG Jun-yong2，DENG Xian-zhen2，ZHANG Xue-hua1，

HUANG Bing-jie1，CHENG Shui-yuan1

（1. Huanggang Normal University，College of Life Science/Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories，Huanggang，438000，Hubei，China;2.Hubei Academy of Forestry，Wuhan 430075，China）

Abstract： The genetic resources of 28 Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon） with ancient major clique and 8 samplea from Luotian county， Macheng city of Hubei province were analyzed with Inter simple sequence repeat （ISSR） markers. Xiaoseshi， Wuhe， Baogai and Qiuyan were used for screening primers. The results shows that 9 dolymorphic primers were screened from a total of 21 ISSR ones. The genomic DNAs of 40 varieties were amplified to obtain a total of 185 bands， with polymorphism rate of 100%. 40 persimmon major cliques were devided into two categories by Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis， using NTSYS2.10e software. The genetic similarity coefficient was ranged from 0.39 to 0.92. Luotian sweet persimmon trees had abundant genetic resources with genetic diversity. It will provide a theoretical foundation for identifying Luotian sweet persimmon cultivars， and effectively utlizing germplasm resources.

Key words： Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）; Inter simple sequence repeat; germplasm resources; identification

柿（Diospyros kaki Thunb）是我國五大木本糧油樹種之一，其果實、果蒂和葉片富含維生素C、多糖、碘、單寧等營養成分[1]，可廣泛應用于食品、藥品、飲料等工業領域。作為世界上惟一自然脫澀的甜柿品種羅田甜柿（D. kaki cv. Oriental persimmon）在湖北省羅田縣已有千余年的栽培歷史。現在羅田甜柿是中國地理標志產品，種植面積已發展到0.24萬hm2，年產甜柿0.6萬t，鮮果收入達1.44億元，是羅田縣極具發展潛力的木本糧油產業之一[2]。

柿種內的變異極為豐富，芽變品種多，所以品種間的親緣關系不明析，嚴重影響了柿資源的推廣、育種親本的選配和栽培立地條件的選擇[3]。由于傳統的植物形態鑒定存在時效性較差、容易受到環境與主觀因素的影響等特點，難以進一步弄清羅田甜柿種質資源的親緣關系。因此，利用分子標記技術結合形態鑒定手段是理順羅田甜柿親緣關系的有效途徑。簡單重復序列間擴增（Inter simple sequence repeat，ISSR）分子標記是類似隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標記的一種聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術[4]，是近幾年來在微衛星（Microsatellite）分子標記基礎上發展起來的一種新型分子標記技術[5];ISSR標記能有效揭示種群內的遺傳多樣性，進而分析其系統分化規律，研究群體遺傳結構及其多樣性程度[6]。然而ISSR技術極易受模板、引物以及Taq酶等因素的影響，任何一個因素的改變都可能使擴增產物發生變化。為此需要對甜柿ISSR分子標記的反應體系進行優化，使反應結果更加精準。試驗選用ISSR技術探討了羅田甜柿古老優樹種質資源的基本情況，以期能夠更快速、準確、簡便地鑒定這些古老優樹間的親緣關系，從分子學水平上為羅田甜柿種質資源的收集、鑒定和發展利用提供參考依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料 ?羅田甜柿植物材料為湖北省羅田縣不同鄉鎮的古老優樹28個樣品，以麻城市不同鄉鎮的8個樣品作為參照，用羅田縣農家品種無核（W）、寶蓋（B）、小澀柿（S）、秋焰（Q）為篩選引物提供參考。每個樣品隨機選取10～20片幼嫩葉片，田間采葉后裝入做好標記的自封袋中，迅速送到黃岡師范學院經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。材料來源和編號見表1。

1.1.2 ?主要試劑 ?瓊脂糖、5×TBE緩沖液、2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司;CTAB提取DNA試劑、30%聚丙烯酰胺、過硫酸胺、TEMED、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸等購自武漢貝爾生物技術有限公司;Maker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?羅田甜柿基因組DNA的提取與檢測 ?試驗參考梁玉琴等[7]的CTAB法，略做改進，提取40個羅田甜柿優系葉片的總基因組DNA。在0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳中檢測所提取基因組DNA的質量，紫外分光光度計檢測DNA的濃度，提取的總DNA保存于-20 ℃冰箱中，備用，-4 ℃為短期存放條件。

1.2.2 ?引物來源及ISSR-PCR擴增反應體系的建立 ?試驗所用引物是依據柿的EST文庫篩選出的ISSR序列，參照加拿大哥倫比亞大學網站公布的ISSR引物序列，共設計出21條擴增引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR擴增反應體系為20 μL，包括2×Taq PCR MasterMix反應液（0.1 U/μL Taq Polymerase、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2 及其他穩定劑和增強劑）10 μL，引物2 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 加至20 μL。擴增程序設為94 ℃預變性3 min;然后94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35個循環;最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 ?引物篩選 ?選用基因組DNA純度較高的羅田甜柿樣品為模板，分別對21個引物采用以上擴增程序進行PCR擴增。擴增產物先用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步分析，篩選出的多態性較高的引物用于40個羅田甜柿樣品的鑒定。

1.3 ?統計與分析

將擴增的PCR產物全部上樣6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，在350 V電壓下電泳約140 min，經硝酸銀染色、氫氧化鈉顯影，所獲得的擴增條帶以0、1統計建立數據庫。條帶統計以其清晰可重復為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置上有帶記為1、無帶記為0。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據SM相似系數法求得品種間的遺傳相似性矩陣，再用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行聚類分析，構建系統聚類分析樹狀圖[8]。

2 ?結果與分析

2.1 ?引物篩選結果

隨機選取秋焰的DNA為模板，分別對21條ISSR擴增引物進行篩選，淘汰無擴增產物和多態性差的引物，選留擴增條帶清晰且有明顯多態性片段的引物，結果見圖1。根據瓊脂糖電泳得到的初步檢測結果，結合聚丙烯酰胺電泳（圖2）結果的進一步分析，從中篩選出了9個引物，具體見表2。分析可見，這些引物均能在供試羅田甜柿樣品中擴增出清晰、穩定、重復性和多態性較高的條帶。如圖1結果顯示，在泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21中均有多態性條帶，說明對應編號的引物都可為ISSR引物篩選提供參考，因此對其他泳道沒有顯示多態性條帶的引物予以淘汰。圖2顯示，泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21的多態性條帶數清晰，再結合圖1初步篩選的結果，確定9條引物（表2）用于40個羅田甜柿優系的認證和鑒定。

2.2 ?ISSR多態性分析及指紋分析

用篩選出的9個引物分別對40個羅田甜柿樣品提取的基因組DNA進行PCR擴增，經統計，共擴增出185條DNA條帶，其中多態性條帶185條，平均每個引物擴增出20.1個條帶，平均多態性位點率為100%，具體結果見表2。從表2可見，不同引物擴增出的條帶數有較大的差異，如引物ISSR3、ISSR21擴增出的條帶較多，分別為29、27條，而引物ISSR7擴增出的條帶數最少，僅有14條。從表2還可見，所選擇的引物多態性達100%。9條引物能分別建立相應的DNA指紋圖譜（因為圖多，文中省略），由各引物擴增效果所反映出的DNA條帶多態性能較好地區分開各個羅田甜柿的優系。

2.3 ?羅田甜柿優系間的遺傳相似性分析

用NTSYS2.10e軟件計算甜柿優系間的Dice遺傳相似系數，結果見表3。由表3可知，40個羅田甜柿優系間的遺傳相似系數范圍為0.39～0.92，平均遺傳相似性系數為0.71。以羅田縣平湖鄉東沖畈村在海拔148 m處采集的1號優系樣品和從羅田縣大崎鄉平頭嶺村海拔588 m處采集的9號優系樣品遺傳相似性系數最大，都為0.92，說明這2個優系親緣關系很近，有可能源自同一株樹。其次是從東沖畈村海拔98 m、平頭嶺村海拔473 m處采集的3、7號優系樣品，相似性系數都為0.90，表明它們之間的親緣關系很接近，遺傳差異較小。而從平頭嶺村海拔588 m處采集的9號優系樣品與從羅田縣三里畈鎮夏家鋪村海拔296 m處采集的13號優系樣品具有最小的遺傳相似性系數，僅為0.39，可見它們之間的遺傳差異比較大，親緣關系較遠。

2.4 ?聚類分析

在獲得兩兩不同優系間的Dice遺傳相似系數基礎上，以185個位點的譜帶為原矩陣，采用UPGMA法構建了羅田甜柿優系間的遺傳關系系統聚類分析樹狀圖，具體見圖3。分析表明，聚類樹狀圖與優系間的遺傳相似系數反映出的情況基本一致，即遺傳相似系數越高，親緣關系越近，優系間的差異就越小。從樹狀圖可以看出，40份優系材料間的遺傳相似系數范圍為0.39～0.92，表現出豐富的遺傳多樣性。

當遺傳相似系數為0.60時，可將40個優系分為A組和B組2個組。在A組中，麻城市的優系全都聚在該組，羅田縣大部分鄉鎮的優系聚在了一起;在B組中，羅田縣部分鄉鎮的少數優系單獨聚在了一起，說明不同地域之間的優系存在遺傳差異，處在同一鄉鎮的優系之間也存在遺傳差異，從而表現出了該地區野生羅田甜柿的遺傳多樣性;當在遺傳相似系數為0.67處做割線L1時，可以將來自于不同地域的40份資源優系分成4個亞組。其中A組有3個亞組A1、A2、A3，B組仍然單獨聚類成1個亞組。

當遺傳相似系數為0.73時，來自于羅田縣三里畈鎮朱元洞村不同海拔的2個優系聚在了一起，獨自成A3亞組，說明2個優系之間遺傳相似性較高，同時也說明其與來自于其他地域的類群有較遠的親緣關系;在A1亞組中，來自于羅田縣平湖鄉東沖畈村海拔148 m的1號優系與來自于羅田縣大崎鄉平頭嶺村海拔588 m的9號優系在遺傳相似系數為0.92時，聚在了一起，然后又在遺傳相似系數為0.86時與來自于羅田縣河鋪鎮丁家山村的海拔613 m的26號優系聚在了一起，其中1號和9號形成一支，很有可能是同一個母源。當遺傳相似系數為0.90時，來自于羅田縣平湖鄉東沖畈村海拔98 m的3號優系與來自羅田縣大崎鄉平頭嶺村海拔473 m的7號優系聚在了一起;當遺傳相似系數在0.68及以上時，A2亞組又可以分為2個小組，分別表述為A21小組和A22小組。在A22小組中，當遺傳相似系數為0.78時，來自于羅田縣河鋪鎮唐家山村海拔397 m的22號優系與來自于同鎮的丁家山村海拔564 m的24號優系聚在了一起;來自于羅田縣三里畈鎮鏨字石村的2個優系29號和30號也在0.79處相聚，后又在0.75處與同樣來自于鏨字石村的另外一個優系28號相聚在一起。從這個結果可以看出，野生羅田甜柿不同種源之間的差異隨著地理距離的遠近而大小不一。

另外，B組分別為來自于羅田縣三里畈鎮鏨字石村不同海拔的10號、11號、12號3個優系，來自于羅田縣三里畈鎮夏家鋪村不同海拔的13號、14號2個優系，來自于羅田縣平湖鄉毛家洞村的17號、上沖村的18號、大垴村的27號3個優系，等等。值得注意的是同一地域的17號和18號在遺傳相似系數為0.84時相聚，而同一地域的27號與它們的遺傳距離相對較遠，遺傳相似系數為0.67。

從聚類圖的分析中可以看出，在相同的遺傳相似系數處，來自于不同地域的羅田甜柿優系可以聚在一起，說明不同的地域也會有親緣關系比較近的優系;同樣來自于同一地域的優系也會具有不同的遺傳相似系數，說明同一地域的優系彼此之間是存在差異的;正是這種交叉的親緣性和差異性才構成了羅田甜柿的遺傳多樣性。

3 ?討論

對于要求檢測大量樣品的遺傳多樣性研究來說，檢測手段的穩定性至關重要。影響ISSR-PCR反應體系的因素有模版DNA濃度、引物濃度、dNTP、Taq-DNA聚合酶、循環數、退火溫度等方面[9]。徐象華等在柿屬（Diospyros L.）親緣關系研究中完成了RFLP（Restriction fragment length polymorphism）、RAPD、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、SSR（Simple sequence repeats）、ISSR、IRAP（Inter retrotransposon amplified polymorphism）、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）等多種分子標記技術體系的構建，側重于研究國外與國內及國內不同地區間種間的親緣關系[10]。本研究采用ISSR標記通過對羅田甜柿不同地理位置的優系母樹DNA序列的同源程度分析，試圖確定羅田甜柿種質資源分布及地理位置的遺傳差異，以期為進一步的種質資源保存和優系的品種審定提供佐證。

遺傳標記是作物遺傳育種研究的重要工具之一，ISSR以其設備技術簡單、重復性高、多態性豐富的特點將在果樹起源進化及系統分類研究方面發揮重大作用[11]。近年來，公共數據庫的EST數量迅速增加，為ISSR標記的開發提供了一條快速而有效的途徑。不過試驗中由21對引物最終僅篩選出了9對多態性高的引物，說明篩選的效率較低，其原因可能來自兩方面：一是EST數據較少，來源單一，所設計的引物本身就存在較高的冗余度;二是中國的柿屬植物種間親緣關系較近，不易得到有多態性的引物[12]。

果樹在自然界中存在許多天然雜種，不少古老的品種是突變或者自然雜交得到的，其親本來源不明。本次研究的供試材料為湖北省羅田縣、麻城市具有優良性狀的古老的羅田甜柿母樹。我們應用NTSYS2.10e軟件對擴增結果進行UPGMA法聚類分析，結果40個羅田甜柿優系大致被分為兩大類，遺傳相似系數從0.39到0.92。說明羅田甜柿資源分布具有明顯的自然地理分區，分區內又具有遺傳多樣性。例如從麻城市采到的優系全都聚集在A區，而同一采集地的優系樣品又有差異，如采自羅田縣河鋪鎮丁家山村的26號優系就與同樣采摘于丁家山的其他2個優系（24號、25號）相距較遠，說明相同采集地的優系也有親緣關系較遠的情況存在，這可能與早期甜柿的人工移栽種植有關[10]。

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