利用污水廠二級出水對富油微藻藻種的培育和篩選

方 華，段書芬，何 磊，陳 麗，鄭柏洪

(1. 南京信息工程大學環境科學與工程學院，江蘇南京 210044;2. 大氣環境與裝備技術協同創新中心，江蘇南京 210044;3. 江蘇立能環保水處理工程有限公司，江蘇蘇州 215168)

富油微藻被認為是唯一具有完全替代化石燃料潛力的生物柴油原料［1］，但微藻制備生物柴油的高成本制約了該技術發展［2］，而其中微藻培養成本則占到生物柴油生產總成本的70%以上［3］。另一方面，微藻生長的同時也會大量攝取水中的營養物質，利用微藻對污水進行深度脫氮除磷處理，自20 世紀中葉以來即被提出和研究［4，5］。假如能利用污水廠二級出水培養富油微藻，可同步實現富油微藻培養和污水深度凈化，并能大幅降低微藻培養成本，具有極佳的環境效益和經濟效益，而適宜藻種的篩選及其在二級出水中生長和富油特性的研究則是這一技術的基礎。本研究選取了國內外常用于生物柴油制備和污水處理的普通小球藻(Chlorella vulgaris)、二形柵藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和海水小球藻(Chlorella pacifica)等4種微藻為對象，對比研究了它們在二級生化出水中的生長、油脂積累和脫氮除磷性能，以期為篩選出適于在二級出水中培育的富油微藻提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗廢水

采用模擬二級出水［6］為微藻培養液，水質如表1 所示。

表1 二級出水水質Tab.1 Water Quality of Secondary Effluent

1.2 藻種及微藻培養

普通小球藻、二形柵藻和蛋白核小球藻購自中國科學院水生生物研究所，海水小球藻購自青島海洋研究所。采用BG11 為基礎培養基進行藻種的擴大培養。

微藻培養在500 mL 錐形瓶中進行，按1 ∶9(體積比)將藻液接種至滅菌后二級出水中;接種前藻液采用15 mg /L 的NaHCO3溶液清洗2 遍;接種后置于光照培養箱中，溫度為25 ℃、光照強度為8 000 lux、光暗比為12 ∶12 的條件下培養。

1.3 微藻生物量和油脂含量的測定

微藻干重采用重量法測定［7］，藻細胞的光密度值采用分光光度法測定［8，9］。分別建立4 種微藻光密度值與干重的標準曲線，用于微藻生物量計算。培養液中微藻油脂含量采用重量法測定［10］，提取劑為氯仿-甲醇混合液;同步測定藻干重，計算藻細胞含油率。

1.4 微藻生長與氮磷去除模型擬合

利用Logistic 模型對微藻生長特性進行擬合分析。Logistic 模型常用于描述微生物生長速率和生物量之間的關系［11］，其表達式如式(1)所示。

其中t—培養時間，d;

N—t 時刻微藻生物量，mg/mL;

K—微藻最大生物量，mg/mL;

a—初始偏移量;

r—比生長速率，d-1。

當N 為K 的一半時，生物量增長速率最大，以Rmax表示，其計算式如式(2)所示。

利用一級反應動力學模型對氮磷去除進行擬合。一級動力學反應是指反應速率與反應物含量的一次方成正比的反應，可用來描述氮磷等污染物的生物降解過程［12］，其表達式如式(3)所示。

其中—si—t 時刻的營養鹽濃度;

s0—初始的營養鹽濃度;

k—一級反應常數。

1.5 水質分析

TN 采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定;TP 采用鉬酸銨分光光度法測定;COD 采用重鉻酸鉀法測定。培養后藻液以4 000 r/min 離心30 min 后，取上清液測定。

2 結果與討論

2.1 微藻生長特性

模擬二級出水中，4 種微藻生長及其Logistic 模型擬合曲線如圖1 所示，采用origin 軟件所得擬合結果如表2 所示。

圖1 生物量隨時間的變化Fig.1 Variation of Biomass with Time

表2 四種藻的生長特征參數Tab.2 Growth Parameters of Four Species of Microalgae

4 種微藻的生長均呈現出先快速增長后趨于平緩的規律，與經典的微生物批次培養生長特性相符。普通小球藻和二形柵藻的生長速率與生物量顯著高于其他兩種微藻，18 d 時最大藻干重分別可達293.04 和409.94 mg/L。已有研究中，小球藻、柵藻等在BG11 等常用培養基中生長的生物量一般為300 ～500 mg/L 左右［13］;本試驗所用的二級出水雖然氮磷等營養鹽的濃度較低，但培養后微藻生物量與此相近，初步表明二級出水可滿足微藻生長需要。由擬合結果可知，4 種微藻的生長曲線與Logistic 模型相關性均較好;普通小球藻的比生長速率r 最大，為0. 31 d-1;二形柵藻的最大生物量K 最高，為453.49 mg/mL;普通小球藻和二形柵藻的最大生物量增長速率Rmax分別為20.65 與26.08 mg/mL·d，大大高于其他兩種微藻。這些均表明普通小球藻和二形柵藻更適于在二級出水中生長。

2.2 油脂含量與含油率

圖2 油脂含量隨時間的變化Fig.2 Variation of Lipid Productivity with Time

圖3 含油率隨時間的變化Fig.3 Variation of Lipid Content of Time

4 種微藻在模擬二級出水中的油脂含量及藻細胞含油率變化如圖2 和圖3 所示。4 種微藻藻液中油脂含量隨培養時間延長總體呈現先快速增加后趨于穩定的趨勢，與生物量變化規律相似，表明微藻生物量是決定油脂含量的重要因素。培養前期，藻生物量的快速增殖使得油脂含量同步大幅提高;而普通小球藻和二形柵藻因生物量較高，其油脂含量也顯著高于其他兩種微藻，20 d 時分別可達94 和113 mg/L。但與生長曲線不同，油脂含量在培養后期再次呈現上升趨勢，表明微藻進入生長穩定期后存在著顯著的油脂富集過程。

4 種微藻的含油率隨培養時間延長呈現先快速上升、后小幅下降、再上升的趨勢，在培養的中后期與生物量變化存在明顯差異。這表明微藻生長和油脂富集過程中存在著一定的相互制約關系;進入穩定期后，微藻生長速率下降可促進油脂的積累。有研究認為，在氮源受限的條件下，藻細胞中蛋白質和核酸等基本結構物的合成速率降低，使得碳固定的主要產物轉變為碳水化合物和油脂［14］。在培養末期，培養液中氮元素含量大幅降低引起了微藻油脂富集作用加強，從而使得藻細胞含油率及藻液中油脂含量上升。在本研究中，普通小球藻的含油率可達37.46%，明顯高于其他三種微藻，且高于一般培養條件下的普通小球藻的油脂含量(28%～32%)［15］，表現出可觀的產油潛力。

2.3 氮磷去除能力

培養過程中，4 種微藻對TN 和TP 的去除效果如圖4 所示。

圖4 TN 和TP 的去除Fig.4 Removal Rate of TN and TP

由圖4 可知4 種微藻對TN(初始濃度為38.8 ～40.1 mg/L)的去除效果較為接近，隨時間呈現穩步上升的趨勢;培養20 d 后，去除率可達75%左右。4種微藻對TP(初始濃度為2.7 ～3.1 mg /L)的去除效果均較好，短時間內即可達到較好的去除效果(8 d 時去除率達80%以上)，并趨于穩定。微藻為自養型生物，可通過光合作用直接利用水中的無機氮和有機氮合成氨基酸和蛋白質，也可通過多種磷酸化途徑將水中的磷轉化成磷脂等物質，對氮、磷等污染物質具有吸附作用強、凈化效果好的優勢［5］。總體來看，4 種微藻在二級生化出水中均展現出較強的脫氮除磷效能。

采用一級反應方程對微藻培養過程中氮磷去除進行擬合，結果如表3 所示。

4 種微藻的反應速率常數kN較為接近。4 種微藻對磷的去除存在一定差異，其中普通小球藻的反應速率常數kP最高，為0.36 d-1。Wang 等［12］研究表明氮濃度提高可促進微藻對磷的吸收，當培養基中N/P ＞9 時，kP將顯著大于kN;本試驗中N/P 約為12.5 ～14.5，故4 種藻的kP大大高于kN，即微藻對磷的去除要快于對氮的去除，這也與前述的TN 和TP 的去除曲線一致。

3 結論

(1)4 種微藻在二級出水中生長符合經典的微生物生長規律，二形柵藻和普通小球藻可達到較高生物量，分別為409.94 和293.04 mg /L;普通小球藻的比生長率最大(0.31 d-1)，柵藻的最大生物量最高(453.49 mg/mL);兩種藻的最大生物量增長速率分別為20.65 與26.08 mg/mL·d，這表明兩種微藻更適于在二級出水中生長。

(2)普通小球藻和二形柵藻培養后藻液中油脂含量顯著高于其他兩種微藻，分別可達94. 00 和112.63 mg/L;微藻進入生長穩定期后存在著顯著的油脂富集過程;淡水小球藻的含油率最高為37.46%，表現出可觀的產油潛力。

(3)4 種微藻在二級生化出水中均表現出較強的脫氮除磷效果，TP 的去除率都達到80%以上，TN去除率達到75%以上;微藻對磷的去除速率要顯著大于對氮的去除速率。

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