地黃梓醇對(duì)缺氧缺糖損傷的人胚胎腎臟細(xì)胞保護(hù)作用研究

陳靖 付彥君

地黃梓醇對(duì)缺氧缺糖損傷的人胚胎腎臟細(xì)胞保護(hù)作用研究

陳靖 付彥君

目的 研究梓醇對(duì)缺血細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。方法 通過連二亞硫酸鈉消除培養(yǎng)基中的氧,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,模擬缺血環(huán)境中的細(xì)胞損傷;再對(duì)對(duì)照組、模型組、梓醇低、中、高濃度組分別進(jìn)行細(xì)胞存活率、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定。結(jié)果 梓醇能顯著提高細(xì)胞存活率,且在5～20μmol/L呈劑量依賴性,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);梓醇能顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中的TAC、SOD,降低LDH水平,且在5～20μmol/L呈劑量依賴性,與模型組比較,P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)意義。結(jié)論 梓醇可以通過抗氧化損傷保護(hù)缺糖缺氧細(xì)胞。

梓醇; 缺糖; 缺氧; 細(xì)胞保護(hù)

【Key words】 Catalpol; Hypoglycemia; Hypoxia; Cell protection

地黃Rehmanniae glutinosa Libosch,為玄參科地黃屬多年生草本植物的地黃新鮮或干燥塊根,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其具有“滋陰補(bǔ)血,填精補(bǔ)髓”的功效[1],早在公元前718年的周朝時(shí)期就作為皇帝貢品和饋贈(zèng)親友的佳品。目前也是中國重要的創(chuàng)匯產(chǎn)品之一,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷港澳、東南亞及日本等地區(qū)[2],臨床上常用于治療腦卒中,腦卒中后遺癥等[3]。梓醇是地黃的主要成分之一,《中華人民共和國藥典》(一部)2010版以梓醇含量來檢測生地黃質(zhì)量[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),梓醇具有利尿、降血糖、抗腦缺血、保肝及保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞毒性損傷,減少腦缺血后神經(jīng)凋亡等藥理作用[5-7]。腦缺血時(shí),大量細(xì)胞毒性成分誘導(dǎo)的氧自由基是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要原因[8]。本文選用人胚胎腎臟細(xì)胞體外培養(yǎng),通過測定對(duì)照組、模型組、和梓醇低、中、高濃度組的細(xì)胞存活率、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、超 氧化 物歧 化酶(superoxide dismutase,SOD)以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力,探討梓醇對(duì)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

10%胎牛血清RP-MI1640培養(yǎng)液購于Hyclone公司;Earle＇s平衡鹽溶液購于蘇州蘇大賽爾免疫生物技術(shù)有限公司;TAC試劑盒、SOD試劑盒、LDH試劑盒購自南京建成試劑公司;地黃梓醇(地黃提取物,含量大于98.5%)和人胚胎腎臟細(xì)胞由沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院提供;噻唑藍(lán)(MTT)溶液: 100 mg MTT固體充分溶解于20 m L磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.2),用0.22μm微孔濾膜過濾,4℃避光保存。

1.2 缺氧缺糖損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組,缺血缺氧損傷模型組和缺血缺氧損傷后藥物干預(yù)組。取前培養(yǎng)24小時(shí)的人胚胎腎臟細(xì)胞,吸去原培養(yǎng)液,并用Earle＇s液(pH 7.4)洗滌,調(diào)整細(xì)胞數(shù)目約1.5×105個(gè)/mL,接種于96孔板(0.1 mL/孔)。對(duì)照組加入20μL含糖Earle＇s液;模型組加入10μL連二亞硫酸鈉的無糖Earle＇s和10μL含糖Earle＇s溶液;梓醇低、中、高濃度組分別加入10μL連二亞硫酸鈉的無糖Earle＇s液和10μL的不同濃度藥物(5、10、 20μmol/L)。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后觀察并測定有關(guān)指標(biāo)。

1.3 MTT法測定細(xì)胞存活率

取上述96孔板,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL,4小時(shí)后鏡下觀察結(jié)晶情況并每孔加入100μL三聯(lián)液(10%十二烷基硫酸鈉,5%異丁醇, 0.012 mmol/L HCl),再培養(yǎng)10小時(shí)左右后取出,于酶標(biāo)儀640 nm為參考波長,560 nm波長測定吸光度(A)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TAC、SOD及 LDH的測定

吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液作為測試液,按試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理,每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較用SNK法,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01有顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 梓醇對(duì)缺氧缺糖細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果表明,在經(jīng)過造模處理后,模型組細(xì)胞存活率降低,和對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,細(xì)胞存活率提高,與模型組對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。梓醇對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用在5～20μmol/L時(shí),明顯表現(xiàn)出劑量增大,保護(hù)作用增強(qiáng),具體結(jié)果見表1。

表1 梓醇對(duì)缺氧缺糖細(xì)胞存活率的影響(±s,n=10)

注:與對(duì)照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01。

組別 濃度μmol/L A560細(xì)胞存活率(%) 0.121±0.002 100.00±1.31模型組 —— 0.015±0.003a12.40±1.64a梓醇低濃度組 5 0.035±0.003b29.93±1.34b梓醇中濃度組 10 0.052±0.001b42.50±0.08b梓醇高濃度組 20 0.062±0.002b51.24±1.42對(duì)照組 ——b

2.2 梓醇對(duì)缺氧缺糖細(xì)胞 TAC、SOD及 LDH的影響

結(jié)果表明,在經(jīng)過造模處理后,模型組TAC、SOD含量降低,和對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,TAC提高,與模型組對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而模型組LDH含量升高,和對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,LDH含量降低,與模型組對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。梓醇對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用在5～20μmol/L時(shí),明顯表現(xiàn)出劑量增大,保護(hù)作用增強(qiáng),具體結(jié)果見表2。

表2 梓醇對(duì)缺氧缺糖細(xì)胞TAC、SOD及LDH的影響(±s,n=10)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.01,與模型組比較,ybP＜0.01。

組別 濃度μmol/L TAC(U/mL) SOD(U/mL) LDH(U/mL) 21.51±0.53 29.51±1.53 821.51±122.53模型組 —— 2.62±0.43a4.62±1.43a1442.62±221.43a梓醇低濃度組 5 6.51±0.73b10.51±0.83b1206.51±121.73b梓醇中濃度組 10 7.98±0.51b14.98±1.51b1097.98±86.51b梓醇高濃度組 20 10.21±0.92b19.21±0.92b973.21±95.92對(duì)照組 ——b

3 討論

人胚胎腎臟細(xì)胞廣泛應(yīng)用于藥物的細(xì)胞保護(hù)作用研究[9]。在細(xì)胞缺血損傷時(shí),主要是因?yàn)榧?xì)胞缺氧缺糖,繼而產(chǎn)生大量自由基,損傷細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的缺氧缺糖模型是利用連二亞硫酸鈉消除培養(yǎng)基中的氧,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),模擬缺血環(huán)境中的細(xì)胞損傷,方法簡單,結(jié)果穩(wěn)定、可靠[10]。

TAC是酶促體系小分子量的抗氧化物質(zhì)和非酶促體系的抗氧化物質(zhì)的總和,是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)。SOD能清除自由基,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起重要作用。在組織缺血時(shí),TAC和SOD活性降低,氧自由基堆積,氧自由基可轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基自由基,活性增強(qiáng),損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),破壞細(xì)胞膜功能,進(jìn)而加劇缺血組織損傷。LDH廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí), LDH進(jìn)入細(xì)胞外液,活性增高。因此,TAC、SOD水平和機(jī)體抗氧化能力呈正相關(guān),LDH水平和機(jī)體損傷水平呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過測定細(xì)胞存活率及細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中的TAC、SOD、LDH等指標(biāo),證明了梓醇至少通過抗自由基損傷,抗氧化對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用,梓醇對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用,且保護(hù)作用和劑量(5～20μmol/L)呈正相關(guān)性。

[1] 張成秋,辛青,王秀琴.六味地黃丸對(duì)糖尿病腎陰虛證患者血清脂聯(lián)素和高敏C反應(yīng)蛋白的影響[J].中醫(yī)雜志,2013,54 (19):1660-1662.

[2] 張中朋.地黃國際市場前景看好—中國地黃及其制品國內(nèi)外市場簡介[J].中國現(xiàn)代中藥,2005,7(4):43-44.

[3] HF Z,DW,Y L,et al.Catalpol increases brain angiogenesis and up-regulates VEGF and EPO in the rat after permanent middle cerebral artery occlusion[J].International Journal of Biological Sciences,2010,6(5):443-453.

[4] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:116.

[5] 劉明,孫建寧,董世芬,等.梓醇對(duì)永久性腦缺血損傷大鼠恢復(fù)早期運(yùn)動(dòng)感覺功能和能量代謝的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(4):245-249.

[6] 劉江月.梓醇對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈的保護(hù)作用與抗氧化機(jī)制研究[J].中國病理生理雜志,2014,30(6):1023-1028.

[7] 楊清俊,李宗澤,朱艷凌,等.梓醇對(duì)高糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2013,29(3):43-46.

[8] Gong C,Tao G,Yang L,etal.The role of reactive oxygen species in silicon dioxide nanoparticle-induced cytotoxicity and DNA damage in HaCaT cells[J].Molecular Biology Reports,2012,39 (4):4915-4925.

[9] Shi J,Mori E,Mori Y,et al.Multiple regulation by calcium of murine homologues of transient receptor potential proteins TRPC6 and TRPC7 expressed in HEK293 cells[J].The Journal of Physiology,2004,561(2):415-432.

[10] 劉巖,王建,姚洪武,等.開竅藥對(duì)缺血缺氧損傷PC12細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制[J].中藥藥理與臨床,2010,26(4): 35-38.

Study on protective effect of catalpol on injuried HEK293 cell induced by oxygen glucosedeprivation

CHEN Jing,FU Yan-jun. Experiment center for teaching,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China

FU Yan-jun,E-mail:yjfukim@163.com

Objective To study the protectivemechanism of catalpol onchemic cells.M ethods By sodium dithionite and eliminatemedium oxygen at37℃,5%CO2incubator,cell damage of simulated ischemia environment.The cell survival rate,total antioxidant capacity(totalantioxidant capacity,TAC), superoxide dismutase(superoxide dismutase SOD)and lactate dehydrogenase(lactate,dehydrogenase, LDH)determination were compared among the control group,model group,low catalpol group,medium catalpol group and high catalpol group.Results Compared with model group,catalpol can significantly improve the survival rate of cells in a dose-dependentmanner(5～20 mol/L,P＜0.01).Compared with themodel group,catalpol can significantly improve the cell culture supernatant of TAC,SOD,reduce the LDH level with the same trend of survival rate of cells.Conclusion Catalpol can protect OGD cell oxidative damage.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.010

2014-11-21)

(本文編輯:董歷華)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)校2011年度教育科學(xué)研究立項(xiàng)課題(七年制專項(xiàng))

110847 沈陽,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(陳靖),基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教研室(付彥君)

陳靖(1979-),碩士,實(shí)驗(yàn)師。研究方向:藥理學(xué)及中藥藥理學(xué)。E-mail:w2013007@126.com

付彥君(1966-),女,博士,副教授。研究方向:藥理學(xué)及中藥藥理學(xué)。E-mail:yjfukim@163.com