組織因子途徑抑制物-2抑制人前列腺癌細胞的上皮間質轉化

劉樹瀚，宣 強，談宜傲，吳本鶴，孫凌峰，喬龍標，翟路路，孫友文，周林玉

組織因子途徑抑制物-2抑制人前列腺癌細胞的上皮間質轉化

劉樹瀚1，宣 強1，談宜傲1，吳本鶴1，孫凌峰1，喬龍標1，翟路路2，孫友文1，周林玉1

目的探討組織因子途徑抑制物-2（TFPI-2）對人前列腺癌細胞上皮間質轉化的影響。方法將人前列腺癌細胞株PC3M進行培養，并分為3組，分別轉染TFPI-2基因真核表達載體、空載體及不轉染，細胞劃痕實驗和細胞侵襲小室實驗檢測3組細胞的遷移能力和侵襲能力，用轉化生長因子-β1（TGF-β1）處理細胞，倒置相差顯微鏡下觀察3組細胞形態，Western blot法和逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法分別檢測轉染組、轉染空載體組及未轉染組上皮間質轉化標志物-E鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和snail在蛋白和mRNA水平上的表達量。結果細胞劃痕實驗和細胞侵襲小室實驗結果顯示，轉染TFPI-2基因真核表達載體的PC3M細胞遷移率較低（P＜0.05），侵襲細胞數較少（P＜0.05）；顯微鏡下觀察顯示轉染組細胞大多呈上皮型，轉染空載體組及未轉染組細胞大多呈間葉型；Western blot法和RT-PCR法檢測結果顯示，無論在蛋白水平還是mRNA水平，轉染組較轉染空載體組及未轉染組E-cadherin表達產物較多，vimentin和snail蛋白表達產物較少，差異有統計學意義（P＜0.05），轉染空載體組及未轉染組差異無統計學意義。結論TFPI-2可以抑制人前列腺癌細胞的上皮間質轉化，這是其抑制前列腺癌細胞侵襲與轉移的可能機制之一，為基因及生物靶向治療前列腺癌提供新的思路和方向。

組織因子途徑抑制物-2；前列腺癌；上皮間質轉化

前列腺癌是世界范圍內第二常見的男性惡性腫瘤［1］，在美國其發病率已經躍居第一位［2］。近年來，前列腺癌在我國的發病率也迅速增長，日益威脅老年男性健康。腫瘤的侵襲、轉移以及復發是前列腺癌患者死亡的重要原因，因此，探索其發生的潛在機制并積極尋找有效的治療方法已成為人類醫學研究的熱點。近年來研究［3］顯示，上皮間質轉化（epithelial-mesenchyml transition，EMT）是促進包括前列腺癌在內的惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵因素之一。組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）在抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移以及腫瘤血管生成等一系列生理和病理過程中扮演著重要角色，大多數學者認為TFPI-2作為一種廣譜蛋白酶抑制劑，是通過抑制纖溶酶、胰蛋白酶、基質金屬蛋白酶等多種蛋白酶降解細胞外間質來發揮作用的，但其是否通過抑制EMT從而抑制前列腺癌的侵襲與轉移，目前國內外并無研究。該研究首次將TFPI-2與前列腺癌細胞EMT聯系起來，在形態學上及分子水平上觀察TFPI-2對前列腺癌細胞EMT是否有影響，為明確腫瘤的侵襲、轉移機制以及尋找新的治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 載體與細胞株 TFPI-2基因真核表達載體、人前列腺癌細胞株PC3M購自中科院載體實驗室及細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 IMDM、DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（美國Peprotech公司）；脂質體轉染試劑盒Lipofectamine 2000（美國Sigma公司）；PVDF膜、ECL發光液和Western blot檢測試劑盒（美國Millpore公司）；兔抗人TFPI-2多克隆抗體、兔抗人E-鈣黏素（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人波形蛋白（vimentin）單克隆抗體、兔抗人snail蛋白單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體（美國Cell signaling Technology公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（德國Fermentas公司）；CO2細胞培養箱（德國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；24孔transwell板（美國Corning公司）；SDS-PAGE電泳儀、PCR儀（美國Rio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 PC3M以DMEM作為培養基，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育，進行傳代培養。選取生長穩定的3～8代細胞進行實驗。

1.2.2 轉染 PC3M細胞分為3組，以1×106／孔的細胞密度分別接種在6孔板上，當達到60%～80%融合時，按照脂質體轉染試劑盒Lipofectamine 2000說明書分別轉染TFPI-2基因真核表達載體（轉染組）、空載體（轉染空載體組）及不轉染（未轉染組），G418篩選穩定表達株。

1.2.3 細胞劃痕實驗 吸取對數生長期的3組PC3M細胞，分別接種于3個6孔板，細胞密度為2.5 ×105個／孔，于37℃、5%CO2恒溫培養。待細胞融合密度達到70%～80%時，用200 μl的移液器尖頭沿直尺垂直于孔底劃痕，PBS沖洗2～3遍，分別加入2 ml無血清IMDM培養液，于37℃、5%CO2恒溫培養。于劃痕后0 h及48 h進行觀察并拍照。以遷移率作為統計學比較標準，遷移率（%）＝（遷移前兩側細胞層距離-遷移后兩側細胞層距離）／遷移前兩側細胞層距離×100%。實驗獨立重復3次。

1.2.4 細胞侵襲小室實驗 取對數生長期的3組PC3M細胞，制成單細胞懸液后，分別接種至3個24孔transwell板，其中上室中注入200 μl細胞懸液，下室內為500 μl含10%胎牛血清的IMDM培養液，于37℃、5%CO2恒溫孵育48 h后，用棉簽拭去上室內Matrigel膠和細胞，室底細胞以0.1%結晶紫染色5～10 min，顯微鏡下隨機選擇5個視野（200×）計細胞數總和，求其平均值。實驗獨立重復3次。

1.2.5 細胞形態觀察 分別接種3組PC3M細胞于3個培養皿中，在培養液中加入TGF-β1（5 ng／ml）處理，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養48 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。

1.2.6 Western blot法 經PBS液清洗、蛋白裂解液裂解及離心后分別提取經TGF-β1處理后的每組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備SDSPAGE凝膠、SDS-PAGE電泳緩沖液、轉膜緩沖液等相關緩沖液，各組提取25 μg蛋白質樣品，在60 V的恒定電壓下進行電泳，電泳分離后，恒壓轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉，分別用兔抗人TFPI-2多克隆抗體（1∶200）、兔抗人E-cadherin單克隆抗體（1∶200）、兔抗人vimentin單克隆抗體（1∶200）、兔抗人snail蛋白單克隆抗體（1∶100）、兔抗人β-actin單克隆抗體（1∶400）作為一抗，孵育、洗膜后，再用HRP標記的IgG二抗室溫孵育1～2 h，洗膜后，用ECL發光液進行增強化學發光，X線片下顯影。實驗獨立重復10次，以βactin作為內參，利用Quantity One軟件對顯影條帶的灰度值進行分析。

1.2.7 RT-PCR法 經TRIzol裂解液裂解、離心、洗滌及溶解后分別提取經TGF-β1處理后的每組細胞的總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度，取1 μl RNA，按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明，合成cDNA，用Beacon designer v 7.51設計TFPI-2、E-cadherin、vimentin、snail蛋白和β-actin的引物，引物序列見表1，在PCR儀中通過變性、退火、延伸進行PCR反應（30個循環），產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線光源照射顯示條帶。實驗獨立重復10次，以β-actin作為內參，利用Quantity One軟件對顯影條帶的灰度值進行分析。

表1 基因引物序列

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，所有數據以表示，采用單因素方差分析進行比較。

2 結果

2.1 PC3M細胞轉染TFPI-2基因真核表達載體后遷移能力于48 h時觀察顯示，轉染組劃痕寬度較0 h時稍減小，轉染空載體組及未轉染組較0 h時明顯減小。比較3組48 h時劃痕寬度，轉染組劃痕寬度較轉染空載體組、未轉染組寬，而轉染空載體組、未轉染組劃痕寬度基本相等，3組細胞遷移率分別為（29.65±8.33）%、（55.45±10.07）%、（54.06±11.29）%，經方差分析，3組遷移率不全相等（F＝34.957，P＝0.000），轉染組分別與轉染空載體組、未轉染組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但轉染空載體組、未轉染組之間差異無統計學意義。說明PC3M細胞轉染TFPI-2基因真核表達載體后遷移能力明顯降低。見圖1。

2.2 PC3M細胞轉染TFPI-2基因真核表達載體后侵襲能力鏡下觀察顯示轉染組與轉染空載體組、未轉染組比較，侵襲細胞較少。3組侵襲細胞數分別為（90.3±24.3）、（227.1±40.5）、（232.7± 42.7），經方差分析，3組侵襲細胞數不全相等（F＝74.309，P＝0.000），轉染組分別與轉染空載體組、未轉染組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但轉染空載體組和未轉染組之間比較差異無統計學意義。說明PC3M細胞轉染TFPI-2后侵襲能力明顯受到抑制。見圖2。

2.3 各組細胞形態變化用倒置相差顯微鏡觀察轉染組、轉染空載體組、未轉染組PC3M細胞形態，轉染組細胞大多呈多角形“鋪路石樣”，細胞之間連接較緊密。轉染空載體組、未轉染組細胞大多呈梭形“間葉細胞樣”，細胞之間無明顯連接，呈散在生長。見圖3。

2.4 各組細胞TFPI-2、E-cadherin、vimentin和snail的蛋白表達經Western blot法檢測和統計學分析，轉染組有32、31、27 ku 3種分子量的TFPI-2蛋白表達，而轉染空載體組和未轉染組無TFPI-2蛋白表達；以未轉染組作為對照組，轉染組E-cadherin表達較多，為對照組的（1.819±0.105）倍，vimentin和snail蛋白表達較少，分別為對照組的（0.538± 0.034）、（0.458±0.019）倍，與轉染空載體組、未轉染組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但轉染空載體組、未轉染組之間比較，各蛋白表達量差異無統計學意義。見圖4。

2.5 各組細胞TFPI-2、E-cadherin、vimentin和snail的mRNA表達經RT-PCR法檢測和統計學分析，轉染組有440 bp的TFPI-2 mRNA表達，而轉染空載體組和未轉染組無TFPI-2 mRNA表達；以未轉染組作為對照組，轉染組E-cadherin mRNA表達較多，為對照組的（2.104±0.068）倍，vimentin和snail蛋白的mRNA表達較少，分別為對照組的（0.515±0.034）、（0.437±0.017）倍，與轉染空載體組、未轉染組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但轉染空載體組、未轉染組之間比較，各mRNA表達量差異無統計學意義。見圖5。

3 討論

TFPI-2又稱胎盤蛋白-5，人TFPI-2基因位于7q22，全長約7 000 bp，其表達產物是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移、腫瘤血管生成、纖溶、炎癥以及動脈粥樣硬化等一系列生理和病理過程中扮演著重要作用［4］。大量研究［5-6］表明，腫瘤組織中TFPI-2的表達水平與其惡性程度呈負相關性，即腫瘤的惡性程度越高，TFPI-2的表達水平越低。此外，先前的研究［7-8］也表明了TFPI-2可以抑制包括前列腺癌在內的多種腫瘤細胞的體內及體外侵襲能力。本研究中前列腺癌細胞株PC3M無論在mRNA還是蛋白水平上，TFPI-2都沒有明顯表達，通過轉染TFPI-2基因真核表達載體后，TFPI-2在mRNA和蛋白水平上的表達明顯增加；而細胞劃痕實驗和細胞侵襲小室實驗證明轉染TFPI-2基因真核表達載體組的PC3M，遷移能力和侵襲能力都比對照組明顯下降。本研究結果結合先前的研究結果共同表明了TFPI-2可以抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征，也是導致腫瘤患者惡化和復發的病理基礎；其過程涉及到多基因參與、多步驟完成、非隨機動態變化的多種復雜因素。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，致使細胞極性消失、運動能力增強，是惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵因素之一［3，9］。本研究將TFPI-2基因真核表達載體轉染入PC3M，并經EMT誘導劑TGF-β1處理，分別在形態學上及分子水平上觀察，結果顯示轉染空載體組和未轉染組的細胞形態呈典型的間皮細胞樣，散在生長，是細胞發生EMT的典型形態特征，而轉染組的細胞則大多呈上皮細胞樣，細胞間連接緊密，說明EMT可能受到了抑制。分子水平上是以與EMT緊密相關的3種蛋白—E-cadherin、vimentin以及snail作為判斷指標。其中E-cadherin是一類鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，其胞外免疫球蛋白中的組-丙-纈三肽序列相互識別和形成鏈接，加上胞內的α、β連接素與肌動蛋白骨架結合，從而形成穩定的細胞間接觸，其在細胞間黏附連接中扮演著重要角色［10］。E-cadherin被認為是EMT的關鍵分子，當它表達下降，腫瘤上皮細胞則容易發生EMT，導致腫瘤細胞的侵襲能力加強［11］。Vimentin是間質細胞中最主要的中間纖維，存在于中胚層起源的細胞中，如成纖維細胞、內皮細胞和白細胞等，研究［12］表明，其在人類列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、甲狀腺癌等上皮源性腫瘤中存在異常表達，是EMT的又一標志性分子，與腫瘤的侵襲與轉移密切相關。Hendrix et al［13］將vimentin特定的反義寡核苷酸轉染到表達vimentin的細胞株，結果可降低該細胞株侵襲和遷移能力，強調了其在細胞侵襲、轉移中的促進作用。本研究顯示轉染TFPI-2基因真核表達載體的PC3M與轉染空載體組、未轉染組比較，E-cadherin表達較多，vimentin表達較少，說明TFPI-2可能是通過促進E-cadherin的表達和抑制vimentin的表達來抑制人前列腺癌細胞EMT，從而抑制了前列腺癌細胞的侵襲和轉移。

snail蛋白被認為是E-cadherin的一種強烈轉錄抑制因子［14］。其通過其鋅指結構與E-cadherin的啟動子E-box結合，抑制E-cadherin轉錄，從而促進了EMT。研究［15］表明snail蛋白的高表達促進了腫瘤細胞的EMT，提高了腫瘤細胞的運動性和侵襲力。本研究顯示PC3M轉染TFPI-2后，與對照組比較，snail蛋白表達減少，因此TFPI-2通過抑制snail信號途徑來抑制E-cadherin轉錄可能也是抑制前列腺癌EMT機制之一。

綜上所述，TFPI-2抑制了前列腺癌細胞的EMT，這是其抑制前列腺癌細胞侵襲與轉移的可能機制之一，盡管其中許多機制尚未完全明了，但TFPI-2在前列腺癌演進中的生物相關性是一個值得深入研究的方向，可以為前列腺癌甚至是其他惡性腫瘤的基因及生物靶向治療提供一個新的思路與方法。

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Tissuefactor pathway inhibitor-2 inhibits epithelial-mesenchymal transition in human prostate cancer cells

Liu Shuhan，Xuan Qiang，Tan Yi′ao，et al
（Dept of Urology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the influence of tissue factor pathway inhibitor-2（TFPI-2）on epithelial-mesenchymal transition（EMT）in human prostate cancer cells.MethodsPC3M cells were cultured and divided into three groups，respectively transfected with TFPI-2 gene eukaryotic expression vector，empty carrier and nothing.Wound healing assay and thanswell assay were performed to evaluate motility and invasive capacity of three groups PC3M cells.Then the three groups cells were dealt with by transforming growth factor-β1（TGF-β1），cellular morphology was observed with inverted phase contrast microscope.Protein and mRNA levels of characteristic markers（E-cadherin，vimentin and snail）involved in EMT were respectively detected in cells of three groups by Western blot and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.Resultswere statistically analyzed.ResultsWound healing assay and thanswell assay revealed that migration rate of transfected cells was lower（P＜0.05），invasive cells number of that was fewer（P＜0.05）.Transfected cells displayed an epithelial-like morphology，transfected empty-carrier cells and non-transfected cells showed a mesenchymal-like morphology by inverted phase contrast microscope.Western blot and RT-PCR displayed that E-cadherin was more，vimentin and snail were less on protein and mRNA levels in transfected cells compared with transfected empty-carrier cells and non-transfected cells；the difference was statistically significant（P＜0.05），and the difference between transfected empty-carrier cells and non-transfected cells was not statistically significant.ConclusionTFPI-2 can inhibit EMT in human prostate cancer cells.It is one of the possible mechanisms of inhibiting the invasion and metastasis of prostate cancer cell.It will help to provide new train of thought and direction for gene and biologically targeted theropy for prostate cancer.

tissue factor pathway inhibitor-2；prostate cancer；epithelial-mesenchyml transition

R 737.25

A

1000-1492（2015）12-1738-06

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.014.html

2015-08-28接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085MH181）

安徽醫科大學附屬省立醫院1泌尿外科、2膽胰外科，合肥230001

劉樹瀚，男，碩士研究生；周林玉，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhoulinyu6＠126.com；

宣 強，男，副主任醫師，責任作者，E-mail：93873951＠qq.com