ApoE基因敲除高脂血癥小鼠下頜下腺超微結構及上游刺激因子1表達觀察

李 靜，黃大可，桂 麗，賈雪梅

ApoE基因敲除高脂血癥小鼠下頜下腺超微結構及上游刺激因子1表達觀察

李 靜1，2，黃大可3，桂 麗3，賈雪梅1

目的觀察載脂蛋白E（ApoE）基因敲除高脂血癥（HLP）對小鼠下頜下腺超微結構以及上游刺激因子1（USF1）表達影響。方法10只野生型小鼠予普通飼料喂養作為對照組，10只ApoE基因敲除子鼠予高脂飼料喂養作為高脂組。造模6個月后，取眼眶血檢測血脂；取小鼠下頜下腺組織分別進行光鏡、電鏡和免疫組織化學觀察。結果與對照組比較，高脂組膽固醇、三酰甘油和極低密度脂蛋白含量明顯升高（P＜0.05）。HE染色觀察到，高脂組小鼠下頜下腺的腺泡明顯萎縮，細胞排列紊亂。電鏡下，可見高脂組小鼠導管上皮內線粒體嵴斷裂，腺細胞內粗面內質網囊狀擴張，結構松散零亂。免疫組化顯示，高脂組USF1表達下降；平均光密度值與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論HLP可導致小鼠下頜下腺超微結構出現病理改變，USF1表達減少。

高脂血癥；超微結構；上游刺激因子1；下頜下腺；小鼠

高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）是指血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）過高或血清高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）過低的一種全身代謝異常綜合征。研究［1］表明，HLP是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、冠心病、高血壓、糖尿病及膽石癥等多種疾病的重要誘發因素。研究［2］表明，HLP可導致下頜下腺的形態結構異常及分泌功能降低。上游刺激因子1（upstream stimulatory factor，USF1）廣泛參與控制和調節體內糖、脂代謝相關基因的表達。USF1作為家族聯合性高脂蛋白血癥（familial combined hyperlipidemia，FCHL）中第一個相關基因，可以引起患者血液中TC和（或）TG含量上升［3］。目前USF1與家族性混合型HLP以及代謝綜合征的相關性是大家普遍關注的問題。盡管USF1在人體中廣泛存在，但HLP時下頜下腺中USF1的表達以及超微結構的變化尚未見有關報道。載脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）敲除小鼠由于脂質代謝障礙，在病變早期迅速出現明顯的HLP，是目前建立HLP較理想的典型動物模型。該實驗用ApoE基因敲除小鼠給予高脂飲食復制HLP動物模型，對其下頜下腺進行形態學USF1表達變化的觀察，以期為探討HLP對下頜下腺形態及分泌功能的影響提供形態學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑USF1的抗體和SP免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物模型復制及標本制備10只野生型小鼠與10只ApoE基因敲除子鼠購自中國協和醫科大學，清潔級，分為兩組；10只野生型小鼠予普通飼料喂養作為對照組；10只ApoE基因敲除小鼠予高脂飼料（膽固醇0.5%、豬油10%、蛋黃粉10%、維持料59.5%、蔗糖20%）喂養作為高脂組；單籠飼養12周，自由攝食飲水。在此期間各組動物均不限制飲食和飲水。造模6個月后，禁食12 h將兩組小鼠分別經眼眶采血送檢各組TG、TC、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）水平。取下頜下腺組織，用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片厚4 μm，進行染色處理。

1.3 HE染色切片脫蠟至水，入蘇木精染色20 min，再進行鹽酸乙醇分色、藍化，入伊紅染色1 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

1.4 電鏡處理將下頜下腺組織切成3 mm大小，固定于1%鋨酸，環氧樹脂Epon-812包埋，超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，在日產JEO L-1230透射電鏡下觀察并攝片。

1.5 免疫組織化學染色采用免疫組織化學SP法染色。所用抗體及稀釋度如下：一抗為兔抗鼠USF1的抗體，稀釋度分別為1∶80，37℃孵育40 min后，置4℃過夜；二抗為羊抗兔IgG血清，37℃孵育15 min；辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB顯色后脫水、透明和封片。用PBS替代第一抗體作陰性對照。

1.6 計算機圖像分析在光鏡（10×40倍）下，利用Nikon彩色數碼CCD攝像頭捕獲各組下頜下腺HE切片中腺泡和導管圖像，捕獲各組免疫組化染色切片中USF1的圖像，每張切片隨機選取8個視野，再用metamorph生物圖像軟件計算各組USF1免疫陽性細胞的平均光密度（average optical density，MOD）值。

1.7 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，分析各組USF1免疫陽性細胞的MOD值，數據以ˉx ±s表示，兩組資料比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 血脂結果與對照組比較，高脂組TC、TG、 VLDL表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠TG、TC、VLDL的比較（n＝10，）

與高脂組比較：*P＜0.05

項目對照組高脂組t值TC（mmol／L）2.97±0.39*33.37±16.384.872 TG（mmol／L）1.10±0.67*5.17±2.703.940 VLDL（mmol／L）0.52±0.169.83±4.115.946

2.2 HE染色結果對照組小鼠下頜下腺由分泌部和導管部組成，分泌部為混合性腺泡。腺泡飽滿，結構清晰，腺泡細胞為錐體形，胞質染色較淺，細胞核圓形且靠近基底部。導管部包括閏管、顆粒曲管（granular convoluted tubule，GCT）、紋狀管和排泄管4部分組成，其中GCT是一段長而粗的彎曲小管，是嚙齒類動物特有的結構。高脂組小鼠下頜下腺的腺泡出現輕度萎縮現象，細胞排列紊亂，GCT導管上皮細胞萎縮，細胞頂部胞質中嗜酸性分泌顆粒減少，結締組織增生（圖1）。

2.3 電鏡結果正常小鼠下頜下腺導管上皮細胞內線粒體發達，線粒體嵴清晰完整；高脂組線粒體出現嵴斷裂、紊亂、消失、基質溶解（圖2）。正常小鼠下頜下腺腺細胞內粗面內質網豐富，網腔均勻且分布規則，高脂組局部粗面內質網呈囊狀擴張，結構松散零亂（圖3）。

2.4 免疫組化染色結果陰性對照實驗結果顯示為陰性。USF1陽性表達主要定位于小鼠下頜下腺

的腺泡及導管上皮細胞的細胞質和細胞核，免疫組化染色以出現棕黃色顆粒或黃色顆粒為陽性著色，對照組小鼠下頜下腺導管上皮細胞質和細胞核均出現明顯的棕黃色至棕褐色顆粒，高脂組小鼠下頜下腺導管上皮細胞質和細胞核呈現淺黃色顆粒，且細胞質內著色顆粒明顯減少（圖4）。

2.5 計算機圖像分析結果對照組小鼠下頜下腺內USF1的MOD值為（0.67±0.12），高脂組為（0.56±0.06），兩者差異有統計學意義（t＝2.657，P＝0.016）。

3 討論

HLP是由于外源性脂質攝入過多，或體內脂質代謝紊亂等各種原因導致的血漿中TC、TG和（或）LDL過高和（或）HDL過低的一種全身脂代謝異常。臨床研究［4-6］證明，HLP是誘發AS和心腦血管疾病的重要危險因素，對人體健康的損害主要表現在對心血管系統的損傷。下頜下腺產生的多種生物活性物質主要通過旁分泌方式分泌到細胞間隙，直接或間接調節頜下腺的分泌活動，進而調節機體多種生理功能。本實驗中ApoE基因敲除小鼠給予高脂飲食6個月后，其血中TC、TG明顯升高，提示HLP小鼠動物模型造模成功。

本實驗電鏡結果表明，高脂組小鼠下頜下腺導管上皮細胞線粒體嵴斷裂，腺上皮內部分粗面內質網囊狀擴張，提示HLP可以導致下頜下腺超微結構的改變。細胞生命活動所需要能量和蛋白質絕大部分由線粒體和粗面內質網提供，兩者形態結構和數量的變化均受細胞內外環境影響；同時在細胞和組織發生病變或損傷時，線粒體和粗面內質網均是較敏感的反映指標。本實驗觀察到高脂組小鼠下頜下腺線粒體出現嵴斷裂、紊亂，部分粗面內質網呈囊狀擴張等形態結構改變勢必影響其分泌和合成功能。這可能由于HLP時持續升高的TG和游離脂肪酸易造成機體胰島素抵抗，使葡萄糖氧化減少，無氧酵解增加，導致葡萄糖等能量代謝障礙［7-8］。

ApoE基因作為血漿脂蛋白的重要成分，是機體內重要的膽固醇載體，同時也是HLP、AS等疾病發生、發展的重要分子靶標。本實驗結果顯示，ApoE基因敲除高脂組小鼠下頜下腺中USF1的表達明顯下降，可以推測出ApoE基因敲除和高脂飲食對小鼠下頜下腺中USF1表達具有下調作用。

USF1是真核生物體內廣泛分布的一種多功能蛋白質，在機體的生長發育、免疫應答和炎癥反應等方面發揮著重要的作用。近年來，大量的細胞生化分子實驗研究表明：USF廣泛參與控制和調節糖、脂代謝相關基因的表達［9］。Putt et al［10］從USF基因的單核苷酸多態性方面研究，發現USF基因的某些多態性的變化會出現相應個體患FCHL的幾率上升，同時在易患個體中，ApoE的表達量明顯下降；Lee et al［11］研究荷蘭患FCHL的家庭成員發現USF的基因多態性與個體TG及ApoE的血清水平具有顯著關聯。本實驗結果顯示，高脂組小鼠下頜下腺中USF1的表達明顯下降。推測ApoE基因敲除和高脂飲食對小鼠下頜下腺中USF1表達具有下調作用；而USF1的分泌減少將影響血脂代謝水平。其可能機制有：①HLP時大量脂肪細胞產生，腫瘤壞死因子-α［12］、瘦素［13］等細胞因子的高表達在胰島素抵抗發展過程中起著重要作用，使葡萄糖代謝障礙，導致機體合成USF1所需能量不足；②HLP時，血液中血脂濃度長期處于較高水平，內皮型一氧化氮合酶的表達下調使一氧化氮合成減少，進而影響血管舒張功能和血管內皮功能導致下頜下腺血供下降［14］，引起組織缺血低氧，導致USF1的合成下降。

下頜下腺是具有內、外分泌功能的腺體，其對機體各種生理功能的重要調節作用日漸受到人們的普遍關注和重視。本實驗通過建立HLP小鼠模型觀察到HLP可導致下頜下腺超微結構病理改變，USF1表達減少。但是關于HLP導致小鼠下頜下腺導管上皮USF1表達下調的分子機制等問題還有待進一步研究。

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Observation of submandibular gland ultrastructure and upstream stimulatory factor 1 expression in hyperlipidemic ApoE knockout mice

Li Jing1，2，Huang Dake3，Gui Li3，et al
（1Histology and Embryology Teaching and Research Section，3Comprehensive Laboratory，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Library and Information Center，Anhui Medical College，Hefei 230601）

ObjectiveTo observe the expression of apolipoprotein E（ApoE）gene knocking out hyperlipidemia（HLP）in mice submandibular gland ultrastructure and upstream stimulating factor 1（USF1）.MethodsTake 10 wild mice fed with normal feed as control group，10 ApoE knockout mice fed with high fat as hyperlipidemia group.Six months after the model was set up，blood fat in orbital blood was tested.The submandibular gland tissues of the mice were observed by using light microscopy，electron microscopy and immunohistochemistry staining.ResultsCompared with the control group，the cholesterol，triglycerides and very low-density lipoprotein of high-fat group were significantly higher（P＜0.05）.HE staining was observed，the acini of the submandibular glands in hyperlipidemia group was atrophied obviously，and the cells were in disorder.Under electron microscopy，the submandibular gland cell mitochondria crests of mice in hyperlipidemia group were fractured，and rough endoplasmic reticulum cystically expanded，which was loose and messy.ImmunohistochemicalResultsshowed that the USF1 expression in hyperlipidemia group decreased；the difference in average optical density value and the control group was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHLP can result in pathological changes in the mouse submandibular gland ultrastructure and reduction in USF1 expression.

hyperlipidemia；ultrastructure；upstream stimulatory factor 1；submandibular gland；mice

R 332

A

1000-1492（2015）12-1725-04

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.008.html

2015-07-01接收

安徽省教育廳自然科學基金研究項目（編號：KJ2012A164）

安徽醫科大學1組織學與胚胎學教研室、3綜合實驗室，合肥 230032

2安徽醫學高等專科學校圖文信息中心，合肥 230601

李 靜，女，館員，碩士研究生；

賈雪梅，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：jiaxueme＠126.com