組織CDH1基因異常甲基化和血清HE4檢測對卵巢癌和卵巢內異癥囊腫的鑒別價值

孫 蓓，張 熊

(1.陜西中醫藥大學第二附屬醫院婦二科，陜西 咸陽712000；2.咸陽市第一人民醫院檢驗科，陜西 咸陽712000)

組織CDH1基因異常甲基化和血清HE4檢測對卵巢癌和卵巢內異癥囊腫的鑒別價值

孫 蓓1，張 熊2

(1.陜西中醫藥大學第二附屬醫院婦二科，陜西 咸陽712000；2.咸陽市第一人民醫院檢驗科，陜西 咸陽712000)

目的探討組織上皮-鈣粘連素(CDH1)基因異常甲基化和血清人附睪分泌蛋白4(HE4)檢測對卵巢癌和卵巢內異癥囊腫的鑒別價值。方法選取卵巢癌患者(卵巢癌組)38例、卵巢內異癥囊腫患者(內異癥組)41例，另選取子宮或卵巢良性病變患者42例（對照組），采用甲基化聚合酶聯反應技術檢測CDH1基因啟動子區甲基化狀態，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清HE4水平。比較以上指標的變化。結果CDH1 DNA在內異癥組、卵巢癌組及對照組中的甲基化表達率分別為4.8%(2/41)、39.4%(15/38)、2.3%(1/42)。內異癥組的CDH1 DNA甲基化表達率與對照組比較差異無統計學意義(χ2=0.37，P=0.542)，卵巢癌組的CDH1基因甲基化表達率與對照組比較差異有統計學意義(χ2=11.24，P=0.001)，卵巢癌組的CDH1基因甲基化表達率與內異癥組比較差異有統計學意義(χ2=13.79，P=0.000)。血清HE4在內異癥組、卵巢癌組及對照組水平分別為52.7 pmol/L、537.2 pmol/L、50.3 pmol/L，內異癥組血清HE4水平與對照組比較差異無統計學意義(t=0.63，P=0.532)，卵巢癌組的血清HE4水平與對照組比較顯著增高，差異有統計學意義(t=54.27，P=0.000)，卵巢癌組與內異癥組比較顯著增高，差異有統計學意義(t=55.33，P=0.000)。卵巢癌組CDH1基因甲基化DNA表達量與血清HE4水平具有相關性（r=0.527，P＜0.01)，卵巢癌組CDH1甲基化DNA表達量、血清HE4水平分別與CA125水平具有相關性(r=0.539、0.520，P＜0.01)。內異癥組血清HE4水平與CA125水平無明顯相關性(r=0.127，P＞0.05)。結論聯合檢測組織CDH1 DNA甲基化的發生和血清HE4水平可應用于卵巢內異癥囊腫和卵巢癌的鑒別診斷，提高兩種疾病的診斷率。

卵巢癌；卵巢內異癥囊腫；CDH1基因；甲基化；HE4

子宮內膜異位癥(內異癥)是婦科常見病和多發病。內異癥病灶最容易侵犯卵巢，可有粘連性腫塊及直腸子宮凹陷結節，臨床上卵巢內異癥囊腫與卵巢惡性腫瘤較難鑒別[1]。組織上皮-鈣粘連素1(CDH1)基因異常甲基化以及人附睪分泌蛋白4(HF4)作為一種卵巢腫瘤標志物用于卵巢癌的診斷已經引起了人們的廣泛關注。本文通過測定79例卵巢內異癥囊腫和卵巢癌組織HF4水平和CDH1基因甲基化表達率，旨在探討這兩種分子標志物在鑒別這兩種疾病中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2014年10月在我院因盆腔包塊住院手術的患者79例，根據術后石蠟切片病理報告將患者分為卵巢癌組38例、卵巢內異癥囊腫(內異癥組)41例。卵巢癌組患者年齡35～75歲，平均55.3歲；根據2000年FIGO分期，中晚期病例29例，早期病例9例；漿液性囊腺癌20例，黏液性囊腺癌11例，子宮內膜樣癌5例，透明細胞癌2例。內異癥組患者年齡22～49歲，平均33.8歲；增殖期患者21例，分泌期20例。對照組為選取因子宮疾病或卵巢良性病變行手術的患者，患者年齡33～60歲，平均51.2歲。所有研究對象術前3個月內無任何激素治療及雌激素依賴性疾病，所有組織標本置于-80℃冰箱保存待用。

1.2 標本采集及處理 卵巢癌組、內異癥組患者于術前，對照組婦女于體檢時均空腹抽取靜脈血3～5ml，3000 r/min離心15min，取上層血清分裝于聚丙烯EP管內，儲存于-80℃冰箱保存待用。

1.3 檢測方法 采用甲基化聚合酶聯反應技術檢測CDH1基因啟動子區甲基化狀態，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清HE4水平。組織CDH1基因甲基化：內異癥和卵巢癌患者卵巢組織CDH1DNA提取自石蠟包埋組織，采用美國Qiagen公司試劑盒提取CDH1DNA。DNA經亞硫酸氫鈉修飾后在55℃孵育16 h，純化后加氫氧化鈉終止，懸浮于重蒸餾水中備用。反應總體積25 ul，反應條件：95℃，5min→95℃，1min→55℃，1min→72℃，35個循環→72℃，8min→4℃保存。以甲基轉移酶SssI處理正常人外周血細胞DNA做為陽性對照，以SssI未處理的正常人外周血細胞DNA作為陰性對照，以重蒸餾水作為空白對照。1000 bp DL2000作為分子質量標記。引物序列：甲基化引物：上游5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'，下游引物5'-TAACTAAAAATTCACCTAC CGAC-3'，擴增產物110 bp；非甲基化引物：上游5'-TAATTTTAGGTTGAGGGGTTATTG-3'，下游5'-CACAACCAATCAACAACACA-3'，擴增產物100 bp。CDH1甲基化基因經PCR擴增后由限制性內切酶Rsa1消化，經3%瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察結果。CDH1基因甲基化DNA定量檢測操作嚴格按照產品說明書進行。

1.4 統計學方法 數據用SPSS18.0統計軟件分析，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清CA125水平比較 血清CA125在內異癥組、卵巢癌組及對照組中的水平分別為(75.3±13.2)kU/L、629.5±79.7)kU/L、(20.9±6.2)kU/L。內異癥組、卵巢癌組的血清CA125水平與對照組比較明顯增高，差異有統計學意義(t=30.07，60.01，P=0.000)；卵巢癌組的血清CA125水平與內異癥組比較顯著增高，差異有統計學意義(t=54.13，P=0.000)。

2.2 各組組織CDH1基因甲基化發生率比較 CDH1在內異癥組、卵巢癌組及對照組中的甲基化表達率分別為4.8%(2/41)、39.4%(15/38)、2.3%(1/42)。內異癥組的CDH1基因表達率與對照組比較差異無統計學意義(χ2=0.37，P=0.542)，卵巢癌組的CDH1基因甲基化表達率與對照組比較差異有統計學意義(χ2=11.24，P=0.001)，卵巢癌組的CDH1基因甲基化表達率與內異癥組比較差異有統計學意義(χ2=13.79，P=0.000)。

2.3 各組組織CDH1 DNA甲基化表達量結果比較 CDH1在內異癥組、卵巢癌組及對照組中的甲基化表達量分別為(0.20±0.04)、(0.51±0.1)、(0.19±0.03)。異位內膜組的CDH1DNA甲基化表達量與對照組比較差異無統計學意義(t=1.72，P=0.093)，卵巢癌組的CDH1甲基化表達量與對照組比較差異有統計學意義(t=26.81，P=0.000)，卵巢癌組的CDH1甲基化表達量與內異癥組比較差異有統計學意義(t=25.00，P=0.000)。

2.4 各組血清HE4水平比較 血清HE4在內異癥組、卵巢癌組及對照組中的水平分別為52.7 pmol/L、537.2 pmol/L、50.3 pmol/L。內異癥組的血清HE4水平與對照組比較差異無統計學意義(t=0.63，P=0.532)，卵巢癌組的血清HE4水平分別與內異癥組、對照組比較顯著增高，差異有統計學意義(t=55.33，54.27，P=0.000)。

2.5 相關性分析 卵巢癌組CDH1基因甲基化DNA表達量與血清HE4水平具有相關性(r=0.527，P＜0.01)，卵巢癌組CDH1甲基化DNA表達量、血清HE4水平分別與CA125水平具有相關性(r=0.539，0.520，P＜0.01)。內異癥組血清HE4水平與CA125水平無明顯相關性(r=0.127，P＞0.05)。利用ROC曲線來評價各項標志物的價值，卵巢癌組以內異癥組為參照，血清HE4水平的AUC為0.938(P＜0.01)，組織CDH1 DNA甲基化表達量的AUC為0.719(P＜0.01)。聯合檢測血清HE4和組織CDH1DNA甲基化發生率的AUC為0.953(P＜0.01)，即血清HE4和組織CDH1 DNA甲基化發生率在鑒別卵巢癌與內異癥疾病中有診斷意義。單獨檢測血清HE4和組織CDH1DNA甲基化發生率分別用于診斷卵巢內異癥囊腫時，以對照組為參照的AUC分別為0.239，0.253(P＞0.05)，即單獨檢測血清HE4和組織CDH1DNA甲基化發生率無獨立診斷卵巢內異癥囊腫的意義。

2.6 敏感度和特異度分析 當特異度為95%、內異癥組以對照組為參照時，血清HE4和組織CDH1 DNA甲基化表達發生率診斷內異癥囊腫的敏感度分別為13.7%、7.0%；同樣，在特異度為95%、卵巢癌組以內異癥組為參照時，兩標志物診斷卵巢癌的敏感性為83.2%、52.6%，而聯合檢測的敏感度為87.9%。

3 討 論

HE4在人附睪上皮細胞中最早被發現，被認為是附睪特有的、與精子成熟有關的蛋白質[2]。Galgano等[3]研究認為HE4在正常的卵巢上皮細胞中不表達，而在卵巢漿液性癌及卵巢子宮內膜樣癌細胞中有高表達，因此HE4可作為診斷卵巢癌的一種血清標志物，尤其對于早期卵巢癌的診斷[2]。還有報道認為，HE4也可以作為診斷子宮內膜癌的標志物[4]。HE4在內異癥病灶組織能否表達尚不明確，國內有報道顯示，卵巢內異癥囊腫患者血清HE4水平并無升高[5]。本研究結果顯示，血清HE4水平在卵巢內異癥組沒有增高(P＞0.05)，而在卵巢癌組則顯著增高(P＜0.01)，通過ROC工作曲線分析顯示HE4在鑒別卵巢癌與內異癥疾病中有診斷意義(P＜0.01)，以上提示血清HE4可以作為鑒別診斷卵巢內異癥囊腫和卵巢癌的依據。

DNA甲基化的改變在腫瘤的發生過程中發揮重要作用，其在腫瘤的早期和晚期都會出現，高甲基化誘導沉默抑癌基因，低甲基化促進原癌基因激活，促進腫瘤發展[6]。卵巢癌的發生與DNA高甲基化密切相關，有研究認為，在正常卵巢組織中細胞粘附基因CDH1等呈非甲基化狀態，而在卵巢癌組織中出現高甲基化[7]。沈文靜等[8]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測63例原發性卵巢上皮癌和41例盆腔轉移性卵巢癌患者組織CDH1基因啟動子區甲基化狀態，結果發現兩病例組的CDH1基因啟動子區甲基化的發生率分別為28.6%和39%，顯著高于對照組。本研究結果顯示，卵巢癌組DNA甲基化發生率及甲基化DNA表達量均高于內異癥組及對照組(P＜0.01)，內異癥組及對照組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。ROC工作曲線分析也和本研究結果相符。據此推測，CDH1基因的異常甲基化在卵巢癌的發生過程中起要作用，其在子宮內膜的非甲基化狀態提示CDH1基因甲基化發生的檢測可用于卵巢內異癥囊腫和卵巢癌的鑒別診斷。

組織CDH1 DNA甲基化的發生和血清HE4水平具有相關性，在卵巢癌組兩種標志物分別與CA125水平也有相關性，提示CDH1 DNA甲基化的發生和HE4可能與卵巢癌的發生和發展相關。本文研究顯示卵巢組CDH1 DNA甲基化的發生和HE4水平檢測較子宮內膜組有更高的靈敏性，因此聯合檢測組織CDH1 DNA甲基化的發生和血清HE4水平可應用于卵巢內異癥囊腫和卵巢癌的鑒別診斷，提高兩種疾病的診斷率。

[1]謝 幸,茍文麗.婦產科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2013:324.

[2]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402-408.

[3]Galgano MT,Hampton GM,Frierson HF Jr.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues[J]. Mod Pathol,2006,19(6):847-853.

[4]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.Utility of a novel serum tumor biomarker HE4 in patients with endometrioid adenocarcinoma of the uterus[J].Gynecol Oncol,2008,110(2):196-201.

[5]劉亞南,葉 雪,程洪艷,等.人附睪分泌蛋白4聯合CA125在卵巢惡性腫瘤與子宮內膜異位癥鑒別診斷中的價值[J].中國婦產科雜志,2010,45(5):363-366.

[6]Esteller M.Epigenetics in cancer[J].N Engl J Med,2008,358(11):1148-1159.

[7]于 歌,王 晶.卵巢癌DNA甲基化的研究進展[J].實用腫瘤學雜志,2013,27(1):81-84.

[8]沈文靜,郭科軍,戴冬秋,等.CDH1基因異常甲基化在上皮性卵巢癌中的檢測及臨床意義[J].中國實用婦科和產科雜志,2007,23(7):520-522.

Value of abnormal methylation of CDH1 gene and the detection of serum HE4 in the identification of ovarian cancer and ovarian endometriosis cyst.

SUN Bei1,ZHANG Xiong2.1.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang712000,Shaanxi,CHINA;2 Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Xianyang City,Xianyang712000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the abnormal methylation of CDH1 gene and the detection of serum human epididymis protein4(HE4)in the identification of ovarian cancer and ovarian endometriosis cyst.MethodsThirty-eight patients with ovarian cancer(group A),41 patients with ovarian ectopic cyst(group B)and42 patients with benign uterine or ovarian lesion(the control group)were enrolled in the study.The methylation status of CDH1 gene promoter region was detected by methylation-specific polymerase chain reaction,and the levels of serum HE4 were detected with enzyme-linked immunosorbent assay.The changes of the above indicators were compared.ResultsThe expression rates of CDH1 DNA methylation in group B,group A,control group were4.8%(2/41),39.4%(15/38),2.3%(1/42),respectively,with no statistically significant difference between group B and the control group(χ2=0.37,P=0.542),but statistically significant difference between group A and the control group(χ2=11.24,P=0.001),as well as between group A and group B(χ2=13.79,P=0.000).The levels of serum HE4 in group B,group A and control group were52.7 pmol/L,537.2 pmol/L,50.3 pmol/L,respectively,with no statistically significant difference between group B and the control group(t=0.63,P=0.532),but statistically significant difference between group A and the control group(t=54.27,P=0.000),as well as between group A and group B(t=55.33,P=0.000).In group A,the DNA expression quantity of CDH1 gene methylation and levels of serum HE4 are correlated(r=0.527,P＜0.01),which are respec-tively correlated to CA125 levels(t=0.539,0.520,P＜0.01).In group B,the levels of serum HE4 had no correlation with CA125 levels(r=0.127,P＞0.05).ConclusionJoint detection of CDH1 gene methylation and serum HE4 levels can be applied to the differential diagnosis between ovarian endometriosis cyst and ovarian cancer,which improves the diagnosis rate of the two kinds of diseases.

Ovarian cancer;Ovarian endometriosis cyst;CDH1 gene;Methylation;HE4

R737.31

A

1003—6350（2015）20—3023—03

2015-02-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1100

孫 蓓。E-mail：liyaping0080@126.com