山楂果醋醋酸發酵工藝研究

王彥安，邱松山 ，王云芳，姜翠翠

(1．江蘇科技大學環境與化學工程學院，江蘇鎮江212000;

2．廣東石油化工學院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東茂名525000)

山楂(Crataegus spp．)是薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科山楂屬植物，果實中主要含有黃酮類、低聚黃烷類、有機酸類、微量元素和有機胺類等活性成分［1］。研究表明，山楂具有抗氧化、調節血脂、調節免疫、抗菌等多種生理功能［2－4］。目前國內外山楂系列加工產品主要有罐頭、糖制品、飲料及山楂糕、山楂片等，由于山楂鮮食味道酸澀，山楂飲料及發酵類產品較少［5］。近年來，各種果醋飲品的研究受到越來越多的重視，草莓醋［6］、柿子醋［7］、柑橘醋［8］等各種果醋飲品不斷投入研發并投放市場。目前對山楂醋的研究［9－10］較少，市場上山楂果醋的品種也比較少，因此深加工發酵制備山楂果醋產品，使山楂果醋兼有食醋和山楂的保健功能，具有廣闊的開發應用前景。筆者以山楂為材料，采用響應面法優化山楂醋的發酵工藝，解決山楂鮮果酸澀影響山楂醋品質的問題，獲得營養、風味、口感和色澤俱佳的山楂果醋，從而為山楂果醋的進一步工業應用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料及試劑。新鮮山楂由廣東茂名信宜綠洲生態農業有限公司提供，采摘當天運抵實驗室，分選清洗備用;高活性干酵母，安琪酵母有限公司產品;醋酸菌(滬釀1．01)，廣東石油化工學院果蔬加工與貯藏工程中心實驗室保存菌種;蔗糖為市售一級，葡萄糖、酵母膏為生化試劑;其他試劑為國產分析純試劑。

1．1．2 儀器與設備。RX-700α糖度計，日本愛宕科學儀器有限公司;DA-650臺式電子酒精度計，日本京都電子公司;DHP-9162電熱恒溫培養箱，深圳三利儀器;80-2電動離心機，常州澳華儀器有限公司;PHS-3D型pH儀，上海儀電科學儀器有限公司。

1．2 操作方法

1．2．1生產工藝。山楂→去核→打漿→酶解→澄清過濾→調糖與pH→巴氏殺菌→酒精發酵→醋酸發酵→過濾→調配→灌裝→巴氏滅菌→檢測→成品。

1．2．2 酵母活化。參考文獻［11］的方法，稱取3．0 g安琪活性干酵母，35～38℃條件下6%的糖水復水30 min，然后32℃條件下活化2 h備用。

1．2．3 醋酸菌種活化培養。參考文獻［12］配制酵母膏1%、葡萄糖1%、碳酸鈣1%的醋酸菌活化培養基，加熱溶解、滅菌，冷卻后加入2%的95%乙醇。無菌條件下將醋酸菌種接入醋酸菌活化培養基200 ml/1 000 ml三角瓶中，32℃恒溫培養24 h，備用。

1．2．4 酶解。成熟完好的山楂清洗去核后與涼開水按質量比1∶4 g/ml混合打漿榨汁，加熱至90℃保持10 min。冷卻后添加果汁液總量1%的果膠酶和1%的纖維素酶，45℃水浴酶解3 h。過濾后分裝于250 ml三角瓶中80℃巴氏滅菌10 min。

1．2．5 酒精發酵。參考文獻［13－14］經滅菌的果汁接種5%的酵母活化液，糖度調至18%，pH為3．5，溫度保持30℃進行酒精發酵，定期測定酒精度變化，酒精度不再變化時停止發酵，此時發酵液的酒精度為7．3% ～7．4%。

1．2．6 醋酸發酵。發酵后的酒液中酒精度調至4% ～12%，按接種量為6%～14%接種醋酸菌活化液，溫度控制在26～34℃的范圍內進行單因素試驗。單因素試驗中，初始酒精度分別為4%、6%、8%、10%、12%，接種量分別為6%、8%、10%、12%、14%，發酵溫度分別為 26、28、30、32、34 ℃。

1．2．7 調配與滅菌。以硅藻土為過濾介質，攪拌、靜置、抽濾，直至形成0．5～1．0 cm的濾層且無明顯渾濁時，收集濾液，測定生成醋酸和可溶性固形物的含量，并用山楂果汁、蜂蜜、白糖調配成口感良好、風味獨特的山楂果醋飲料，巴氏滅菌后靜置陳釀一段時間［15］，經檢驗合格即為成品。

1．2．8 醋酸發酵試驗優化。根據單因素試驗得到的優化發酵條件，采用Box-Behnken方法進行試驗設計，選取接種量、初始酒精度、發酵溫度作為考察因素，以+1、0、－1代表高、中、低水平，以發酵后山楂果醋的產酸量為響應值(Y，g/L)，設計3因素3水平共15個試驗點的響應面分析試驗。

表1 Box-Behnken試驗設計的因素及水平

1．3 測定方法 pH采用PHS-3D型pH儀測定;可溶性固形物的含量采用RX-700α糖度計測定;酒精度采用DA-650臺式電子酒精計測定;醋酸含量采用NaOH滴定法測定;感官質量采用感官評定法;還原糖的含量采用直接滴定法［16］測定;VC的含量采用2，6-二氯靛酚法測定;細菌總數采用GB/T4789．2－2008《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》規定的方法測定;大腸菌群采用GB/T4789．3－2008《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數》規定的方法測定。

1．4 數據處理 應用Microsoft Office Excel 2003進行單因素試驗數據處理，Design-Expert 8．06軟件進行響應面數據優化處理。

2 結果與分析

2．1 醋酸發酵單因素試驗

2．1．1 醋酸發酵中初始酒精度的影響。由圖1可知，產酸量隨著初始酒精度的升高而增大，當初始酒精度為8%時產酸量達到最大，之后初始酒精度升高產酸量反而緩慢下降。初始酒精度為8%時，發酵液的產酸量是51．40 g/L，因此選擇發酵初始酒精度為8%。酒精度太低或太高都會限制醋酸菌的生長繁殖從而抑制醋酸發酵。

2．1．2 醋酸發酵中接種量的影響。由圖2可知，產酸量隨著接種量的增加而增大，當接種量為10%時產酸量達到最大，之后接種量升高產酸量反而緩慢下降。接種量為10%時，發酵液的產酸量是52．30 g/L，因此選擇接種量為10%。醋酸菌接種太多使菌種生長受到限制，而接種太少則導致菌種生長過盛從而抑制醋酸發酵。

2．1．3 醋酸發酵中發酵溫度的影響。由圖3可知，產酸量隨著發酵溫度的增加而增大，當發酵溫度為30℃時產酸量達到最大，之后發酵溫度升高產酸量反而緩慢下降。發酵溫度為30℃時，發酵液的產酸量是51．90 g/L，因此選擇發酵溫度為30℃。

2．2 醋酸發酵的響應面試驗 醋酸發酵的響應面試驗結果如表2所示。采用Design-Expert軟件對試驗結果進行回歸分析，得到響應值為Y值(產酸量，g/L)，自變量為接種量(X1，%)、初始酒精度(X2，%)、發酵溫度(X3，℃)的多元二次回歸方程:Y= －819．121 25+22．042 92 ×X1+23．145 56

回歸模型方差分析顯示，F模型=43．98，P模型=0．000 3＊＊;

表2 Box-Behnken試驗結果分析

2．2．1 響應面的交互效應分析。由圖4(a)可知，接種量固定時，初始酒精度的升高使產酸量先增加后下降，隨著接種量的變化，初始酒精度對產酸量的影響發生較大變化;初始酒精度固定時，接種量的增加使產酸量先增加后下降，隨著初始酒精度的變化，接種量對產酸量的影響變化較大。因此接種量與初始酒精度的交互作用對產酸量的影響極顯著，這與方差分析中X1X2的交互效應極顯著一致。

由圖4(b)可知，發酵溫度固定時，產酸量隨著接種量的增加先增加再下降，隨著發酵溫度的變化，接種量對產酸量的影響趨勢保持一致;接種量固定量，發酵溫度的升高使產酸量先增大后下降，隨著接種量的變化，發酵溫度對產酸量的影響趨勢保持一致。因此接種量與溫度的交互效應對產酸量的影響不顯著，這與方差分析中X1X3的交互效應不顯著一致。

由圖4(c)可知，發酵溫度固定時，初始酒精度的升高使產酸量呈先增加后下降的趨勢，隨著發酵溫度的變化，初始酒精度對產酸量的影響趨勢不變;初始酒精度固定時，發酵溫度的升高使醋酸產量先增加后減小，隨著初始酒精度的變化，發酵溫度影響產酸量的趨勢保持一致。可見，初始酒精度與發酵溫度的交互作用對產酸量的影響不顯著，這與方差分析中X2X3的交互效應不顯著一致。

2．2．2 響應面模型驗證。采用Design-Expert軟件優化分析試驗結果，山楂醋發酵試驗的最佳工藝參數為:接種量10．01%、初始酒精度7．38%、發酵溫度為29．74 ℃時，理論產酸量52．05 g/L，為了便于試驗操作，山楂醋發酵的最佳工藝參數簡化為:接種量10%、初始酒精度7%、發酵溫度為30℃，該條件下山楂醋的理論產酸量為51．77 g/L。根據優化的最佳發酵條件(接種量10%、初始酒精度7%、發酵溫度為30℃)進行3次重復檢驗試驗，測得果醋產酸量均值51．76 g/L，與理論值(51．77 g/L)的相對誤差小，表明響應面法優化設計獲得的發酵工藝條件可信。

采用此工藝得到的山楂果醋產品呈亮紅色，無懸浮物和沉淀，酸甜柔和，具有濃郁的山楂果香。總酸(以醋酸計):51．80 g/L;可溶性固形物:7．10%;還原糖(以葡萄糖計):2．75 g/L;VC:869．0 mg/L。細菌總數 ＜100 CFU/ml;大腸菌群、致病菌:未檢出。

3 結論

該研究確定了最佳的山楂醋發酵工藝，醋酸發酵最佳工藝條件為:接種量10%、初始酒精度7%、發酵溫度為30℃，該工藝下醋酸產量51．77 g/L。研究采用Box-Behnken試驗優化果醋發酵，建立關于接種量、初始酒精度、發酵溫度對產酸量的回歸方程:Y=-819．121 25+22．042 92×X1+23．145 56 ×X2+45．423 75 × X3-0．469 17 × X1× X2-0．039 375 × X1× X3+0．077 500 ×X2×X3-0．869 27 ×X12-1．405 37 × X22-0．766 77×X32。響應面試驗中單因素作用和雙因素交互作用對果醋產量的影響體現為:接種量與初始酒精度的交互作用對醋酸的影響極顯著(P＜0．01)，接種量與發酵溫度的交互作用對醋酸的影響不顯著(P＞0．05)，初始酒精度與發酵溫度的交互作用對醋酸的影響不顯著(P＞0．05)。

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