藥用真菌雙向固體發酵草烏后菌質對小鼠的急性毒性及致大鼠心律失常作用

王身艷，劉學湘，王娟紅，陳建偉

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023)

草烏為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根。草烏是臨床應用較多的草藥之一，主要用于風寒濕痹、周身關節疼痛屬于寒濕偏勝者。但是，由于其毒性大，中毒反應快，在臨床應用上受到限制。草烏中毒主要作用于心血管系統、神經系統、呼吸系統和消化系統，對心血管系統和神經系統的毒性最為嚴重，對心臟的毒性最為明顯，對其中毒機理研究報道較多。①直接對心臟的毒性作用，引起嚴重的心律失常，其心律失常的特點是多樣易變，以頻發室性早搏最常見，且為多源性，并容易形成二聯律及陣發性室速、扭轉型室速，甚至發展為室顫，導致猝死。②興奮心臟迷走神經，降低竇房結的自律性和房室結的傳導性，引起竇性心動過緩和房室傳導阻滯。③對神經系統先興奮后麻痹，局部皮膚粘嗅的感覺神經末梢先興奮，有搔癢和燒灼感，繼以麻痹、知覺喪失［1］。

近年來，服用草烏引起的中毒事件仍然時有發生。將藥用真菌接種于草烏基質上，在一定條件下經固體發酵獲得菌質。已有研究表明部分菌質具有保持或增強鎮痛抗炎的作用［2－3］。筆者采用藥用真菌雙向固體發酵技術制備菌質，并對菌質的急性毒性及對大鼠心律失常的影響進行分析，以期為草烏的解毒提供新方法。

1 材料與方法

1．1 藥物 草烏購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，經藥學院陳建偉教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根;靈芝(Ganoderma lucidum(wolfLeyss．)Karst)、茯苓菌(Poria cocos(Schw．)Wolf)、扇菇(Panellusstypticus(Bull．ex Fr．)Karst．)、紅栓菌［Trametes cinnabarina(Jacq．)Fr．］，均由南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所保藏。

1．2 實驗動物 ICR小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(滬)2007－005;SD大鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號為SCXK(滬)2007－0005，飼養于南京中醫藥大學實驗中心 SPF級動物房。

1．3 主要儀器與試劑

1．3．1 主要儀器。AE240分析天平(METTLER公司);MP12001電子天平(上海市橫平科學儀器有限公司);DK-8B型電熱恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司);LDZ5-2低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠);PowerLab/8s生理記錄儀，為澳大利亞AD Instrument公司產品。

1．3．2 試劑。CMC-Na(國藥集團化學試劑有限公司);乙醚(南京化學試劑有限公司)。

1．4 方法

1．4．1 試驗藥物的制備。

1．4．1．1 菌質的制備。在一定的生物技術控制下，運用“固體雙向發酵”技術，分別用靈芝、茯苓、紅栓及扇菇菌發酵草烏，于25～28℃隔水式培養箱中培養40 d后取出，60℃條件下恒溫干燥，粉碎后過120目篩，備用。

1．4．1．2 草烏炮制品的制備。按照文獻［4］中的新法1炮制，取出，60℃條件下恒溫干燥，粉碎后過120目篩，備用。

1．4．1．3 藥物配制。將菌質及草烏炮制品混懸于0．1%的CMC-Na水溶液中，正常對照組給等體積的0．1%的CMCNa水溶液中，臨用現配。

1．4．2 最大耐受量試驗。

1．4．2．1 預試驗。先用 10．0 g/kg 和 2．5 g/kg 劑量分別灌胃，0．02 ml/g每試驗組4只小鼠，雌雄各半，試驗前禁食12 h，不禁水，無1例死亡，將劑量遞增為0．025 ml/g，再試驗4只小鼠，無1例死亡。當劑量遞增至0．04 ml/g時(最大劑量，剛好能用灌胃針頭注射，相當于原藥材16 g/kg)，無1例死亡。

1．4．2．2 最大耐受量試驗。根據預試驗的結果，最大無毒性反應劑量做最大耐受量試驗。取小鼠60只，雌雄各半，體重(20±2)g，灌胃給藥。按預試驗結果，分為炮制品組、正常對照組、栓烏菌質組、靈烏菌質組、扇烏菌質組、茯烏菌質組，每組雌雄各半，每組10只，以最大給藥濃度0．32 g/ml，最大給藥量0．04 ml/g，給藥1次，然后觀察給藥后所有小鼠呼吸，活動(顫抖、跌倒)、眼、瞳孔大小以及飲食、排泄物、皮毛、分泌物，尤其是觀察給藥后5 h內動物的反應情況。然后，每天上下午各觀察1次，記錄中毒癥狀及中毒反應起始時間、嚴重程度、持續時間及記錄給藥前、給藥后第7天和第14天的體重。給藥后各給藥組動物均出現不同程度的中毒癥狀，表現為灌胃15 min后，動物均開始出現不同程度的聳毛及食欲不振的現象，茯烏菌質組及炮制品組還出現流口水、瞇眼或眼睛分泌物增多的現象等中毒癥狀。試驗結束后處死小鼠并解剖，未出現肉眼可見的器官顏色及質地改變的現象。由表1可知，相同劑量下灌胃給藥，在給藥7 d后各處理組體重增長明顯低于正常對照組;給藥14 d后靈烏菌質組體重增長很快，接近于正常對照組。

1．4．2．3 心律失常試驗。取健康成年SD大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，于正式試驗前將大鼠用乙醚麻醉，在Power-Lab/8s生理記錄儀上記錄H導心電圖，無先天心律失常大鼠符合試驗要求。選取合格大鼠48只，隨機分成6組，每組8只，雌雄各半，分別為正常對照組、炮制品組(按生藥計12 g/kg)、茯烏菌質組(按生藥計12 g/kg)、靈烏菌質組(按生藥計12 g/kg)、扇烏菌質組(按生藥計12 g/kg)和栓烏菌質組(按生藥計12 g/kg)。灌胃給藥，每天1次，連續7 d。末次給藥后1 h，腹腔注射20%烏拉坦1．59 g/kg麻醉，仰位固定，先用在PowerLab/8s生理記錄儀試驗系統記錄一段正常H導心電圖，動物心電穩定后，分別記錄心律失常的發生次數。

按照以下公式計算心律失常發生率。心律失常發生率(%)=每分鐘心律失常發生次數/心率×100%。

1．4．3 數據統計與分析。試驗結果均以“均值±標準差”(ˉx±SD)表示，組間比較采用t檢驗，心率失常發生率的比較采用χ2檢驗，采用SPSS17．0統計軟件對試驗數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2．1 最大耐受量試驗結果 給藥后各給藥組動物均出現不同程度的中毒癥狀，表現為灌胃15 min后動物均開始出現不同程度的聳毛及食欲不振的現象，茯烏菌質組及炮制品組還出現流口水、瞇眼或眼睛分泌物增多的現象等中毒癥狀。試驗結束后處死小鼠，解剖后未出現肉眼可見的器官顏色及質地改變的現象。由表2可知，相同劑量下灌胃給藥，在給藥7 d后各處理組體重增長明顯低于正常對照組;給藥14 d后靈烏菌質組體重增長很快，接近于正常對照組。

表1 最大耐受量

表2 最大耐受量體重的變化(n=10) ˉx±SD

2．2 各菌質對大鼠心律失常作用 從圖1和表3可以看出，與炮制品組相比，各發酵組對大鼠心律失常發生次數及發生率有顯著降低作用(P＜0．05或P＜0．01)，各發酵組心律失常發生次數之間沒有顯著差異。

表3 各菌質對大鼠心臟毒性的影響(ˉx±SD，n=8)

3 討論

在急性毒性預試驗中對草烏生品也進行了研究，結果表明在按2．5 g/kg給藥劑量時生品組的小鼠全部死亡，表明草烏生品毒性很大，使用前必須解毒。筆者比較了傳統炮制法和雙向固體發酵法的解毒效果，結果表明雙向固體發酵組對致大鼠心律失常的發生次數與傳統炮制品組有顯著差異，能明顯減少大鼠心律失常的發生次數，降低心律失常發生率，說明發酵解毒效果比炮制解毒效果更好。

藥用真菌發酵中藥自古有之，如神曲、半夏曲等中藥是以自然界的單一或混合的微生物在自然條件下發酵而成，發酵菌種大多為空氣中霉菌、細菌等微生物。雙向性固體發酵是用藥用真菌與具有一定治療作用的藥材在特定的條件下共同培養而獲取菌質的一種方法，其實質是藥用真菌中的酶對中藥中的化學成分進行轉化，產生具有不同生物活性的化學物質。研究表明，雙向固體發酵后的菌質具有降低中藥的毒性或提高中藥藥效等作用［5－6］。

藥用真菌發酵草烏所得菌質具有減毒和增效［2－3］的作用，對菌質化學成分分析、探討發酵的轉化機制以及研究在發酵過程中發揮作用的酶，還有待進一步研究。

［1］林釗華．草烏中毒致惡性心律失常5例的救治體會［J］．現代醫藥衛生，2010，26(20):3132．

［2］王身艷，余黎，劉學湘，等．靈芝雙向固體發酵草烏后菌質抗炎鎮痛作用研究［J］．中國醫藥生物技術，2012，7(5):352 －356．

［3］王身艷，余黎，蔣亞平，等．雙向發酵對草烏中烏頭堿類成分含量影響及菌質抗炎鎮痛作用的初步研究［J］．中國醫藥生物技術，2011，6(4):246－250．

［4］陳龍，蔡寶昌，馬聘，等．草烏幾種炮制品的鎮痛作用比較［J］．中國中藥雜志，1995，20(1):22 －26，61．

［5］王身艷，潘揚，蔣亞平，等．雙向發酵對川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響［J］．中國藥房，2010，21(39):3712 －3714．

［6］劉學湘，潘揚，蔣亞平，等．青木香發酵后總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定［J］．食品與生物技術學報，2010，29(2):202 －204．