農桿菌介導的AtNDPK2基因轉化亞麻的研究＊

郭永霞，王麗艷，孫 強，荊瑞勇，殷奎德

(黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶163319)

亞麻(Linum usitatissimumL．)為雙子葉植物，是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(Linum)的一年生草本植物，是我國重要的經濟作物，油用亞麻是一種重要的油料作物，纖用亞麻是重要天然纖維的來源。我國的亞麻產量和質量水平與發達國家相比有很大的差距，其原因是多方面的，而主要原因之一還是亞麻品種相對比較落后。干旱、鹽堿、低溫等是限制作物生產的主要外界環境條件。目前隨著經濟發展，人口急劇增加，以及全球氣候的變化，這些環境問題在持續加重。其中干旱對作物產量的影響，在各種自然逆境中占據首位，其危害僅次于生物脅迫病蟲害造成的損失，相當于其他自然災害之和。NDPK2基因編碼植物核苷二磷酸激酶2(NDPK2)，Moon H等人發現NDPK2可參與促分裂原蛋白激酶(MAPK)級聯反應，結合MAPK6和MAPK3［1］，進而上調POD、硫氧還蛋白、CAT、過氧化物還原酶和硫氧還蛋白還原酶等多種抗氧化酶基因的表達，從而調節細胞的氧化還原狀態［2］。擬南芥核苷二磷酸激酶2基因(At－NDPK2)通過對馬鈴薯［3］、大麥［4］、苜蓿［5］的遺傳轉化研究也表明:AtNDPK2基因的過量表達可增強作物對干旱、鹽漬或極端溫度的忍耐性。迄今為止，未見有關AtNDPK2基因在亞麻中遺傳轉化的報道。本研究旨在以雙亞7號下胚軸為外植體，通過對遺傳轉化條件的優化來建立穩定的遺傳轉化體系。具體是采用農桿菌介導的方法，將脅迫誘導型啟動子SWPA2與AtNDPK2基因構建共表達載體導入雙亞7號，以期獲得耐性更強的轉基因亞麻，為亞麻抗逆品種的培育奠定基礎，同時也為亞麻基因工程操作技術提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試亞麻品種雙亞7號由黑龍江省科學院亞麻研究所夏尊民研究員惠贈。培養5 d的亞麻下胚軸外植體做為轉化體系優化和基因轉化的材料。

根癌農桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105和質粒pCAMBIA2300由韓國生命工學研究院環境生命工學研究中心的郭尚珠教授惠贈。

含有目的基因AtNDPK2的重組質粒載體也由郭尚珠教授惠贈，包含脅迫誘導型啟動子SWPA2，并攜帶目的基因AtNDPK2，npt－Ⅱ為篩選標記基因。

1．2 試驗方法

1．2．1 選擇培養基中抗生素的種類和篩選濃度的確定 選取雙亞7號5 d的無菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養基上，15 d繼代一次，30 d后統計下胚軸的分化增殖情況。Kan和G418濃度均設置為0，50，100，150，200 mg·L-1，每個處理接種10個下胚軸，5次重復，總計接種50個下胚軸，取5次重復的平均值。

1．2．2 最佳預培養時間的確定 選取雙亞7號培養5 d的無菌苗下胚軸，轉化前在分化增殖培養基上設置0、1、2、3、4、5 d時間進行預培養，經相同的農桿菌處理濃度、相同共培養時間和相同篩選條件，每個處理接種10個下胚軸，5次重復，總計接種50個下胚軸，取5次重復的平均值。培養30 d后，通過統計分析，比較不同處理的抗性再生率，以確定最適的預培養時間。

1．2．3 最佳共培養時間的確定 以雙亞7號為材料，切取下胚軸并侵染后，置于共培養基上，分別共培養0，1，2，3，4，5 d，然后轉入含有一定濃度篩選抗生素的培養基上，每個處理接種10個下胚軸，5次重復，總計接種50個下胚軸，取5次重復的平均值。培養30 d后統計抗性芽誘導率。

1．2．4 農桿菌介導AtNDPK2基因的轉化及植株再生 將雙亞7號和晉亞7號培養5 d苗齡的無菌苗下胚軸在切成0．5 cm左右，搖動10-15 min。然后用滅過菌的濾紙吸干下胚軸表面的農桿菌，置于不含抗生素的共培養基上共培養3 d，共培養結束后將下胚軸轉入含50 mg·L-1G418和250 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養基中，在(25±2)℃，14 h/10 h光周期條件下培養45 d，每15 d繼代一次。當分化出抗性小芽后，將抗性小芽轉接到加有篩選抗生素G418的加有Cef的分化增殖培養基中進行分化增殖培養。培養一定量的抗性小芽后，將抗性小芽轉入芽伸長培養基中繼續培養。待小苗長至3-4 cm左右時，從基部切成單株，轉接到生根培養基上進行生根培養。生根培養基中同樣加有G418。

1．2．5 再生植株的PCR檢測 用目的基因特異性引物進行目的基因的PCR擴增，反應產物在含EB的1．2%的瓊脂糖凝膠上電泳25-30 min，用凝膠成像系統拍照。根據AtNDPK2基因序列設計特異性引物，引物1:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3';引物2:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，擴增的目的片段大小為540 bp，擴增時以未轉化植株葉片DNA作為陰性對照，質粒DNA作為陽性對照。

2 結果與分析

2．1 選擇培養基中抗生素的種類和篩選濃度的確定

選取雙亞7號培養5 d的無菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養基上，15 d繼代一次，30 d后統計下胚軸的分化增殖情況，結果如圖1所示。

圖1 選擇培養基中抗生素的種類和濃度對增殖系數的影響Fig．1 Effect of type and concentration of antibiotic in selective media on proliferation coefficient

由圖中可以看出，兩種抗生素對亞麻下胚軸分化增殖的影響差異很大，其中G418濃度為50 mg·L-1時，培養30 d后，下胚軸已經枯死;而對Kan來說，隨著濃度的增加，增殖系數略有下降，但從方差分析來看，從0、50、100、150 mg·L-1之間，增殖系數沒有顯著性差異，0、50、100 mg·L-1與200 mg·L-1之間有顯著性差異，150與200 mg·L-1之間無顯著性差異。當Kan濃度增加到200 mg·L-1時，增殖系數仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素，選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1。

2．2 不同預培養時間對亞麻遺傳轉化的影響

轉化前的預培養對于植物遺傳轉化具有重要意義，本試驗對亞麻下胚軸分別進行了0、1、2、3、4、5 d的預培養，45 d后統計轉化率(轉化率=產生抗性芽的個數/接種的下胚軸總數)結果如圖2。

從圖中可以看出，預培養時間對轉化率有一定的影響，呈現先升高后降低的趨勢，其中培養2 d時下胚軸轉化率最高為7%，其次是培養3d時的轉化效率為6%，但從方差分析可以看出，培養2 d和培養3 d轉化率沒有顯著性差異，但與其它的培養時間0，1，4，5 d均存在顯著性差異。因此本試驗選擇預培養2 d進行轉化試驗。

圖2 不同的預培養時間對亞麻下胚軸轉化率的影響Fig．2 Effect of different pretreatment time on conversion percent of flax hypocotyl

2．3 共培養時間對轉化率的影響

農桿菌與外植體共培養在整個轉化過程中是非常重要的環節，因為農桿菌的附著、T-DNA的轉移和整合都在這個時期內完成，因此確定共培養條件是轉化成功的關鍵。最佳共培養時間的確定，一方面使農桿菌附著外植體表面后在創傷部位生存一定時間后能夠誘發腫瘤，因此共培養時間不能太短，但也不宜太長，否則，可能會由于農桿菌的過度生長而使植物細胞受到毒害而死亡，不死亡也會在后續培養中難以抑制。因此確定一個適宜的共培養時間是一個好的轉化體系所必須的。試驗結果圖3所示。

圖3 共培養時間對亞麻下胚軸轉化率的影響Fig．3 Effect of co-culture time on conversion percent of flax hypocotyl

從圖中可以看出，外植體與農桿菌的共培養時間對轉化率有較大的影響，隨著共培養時間的增加轉化率呈現先增加后減小的趨勢，當共培養3 d時，轉化率最高達20．45%，不進行共培養時，轉化的率為0，原因是因為農桿菌附著在外植體表面并不能立刻轉化，只有在創傷部位生存8-16 h之后的菌株才能誘發腫瘤。超過3 d后轉化率下降，是因為共培養后在篩選培養基中有的外植體死亡，有的長出農桿菌，因此導致總的轉化率降低。從方差分析可以看出，共培養3 d與其它共培養時間的轉化率之間存在顯著性差異，因此選擇3d做為共培養的最佳時間。

2．4 農桿菌介導AtNDPK2基因的轉化及植株再生

將雙亞7號培養5 d苗齡的亞麻，下胚軸切成0．5 cm左右，放在預培養培養基中培養2 d后，取出放于OD0．6-0．8的農桿菌菌液中搖動10-15 min。然后用滅過菌的濾紙吸干下胚軸表面的農桿菌，置于不含抗生素的共培養基上共培養3 d，共培養結束后將下胚軸轉入含50 mg·L-1G418和300 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養基中。當培養30 d左右，下胚軸大部分形成的愈傷組織及分化的小芽死亡，只有少數的小芽能夠繼續存活(圖4A)，存活率能達到23．5%。將抗性小芽轉接到芽伸長培養基中培養，抗性小芽長高(圖4B)，將其分成單株接種到加有50 mg·L-1的G418生根培養基中，10 d左右能長出大約15條/株的根，形成抗性植株(圖4C)。

圖4 G418抗性植株的生長過程Fig．4 Growth process of Resistance plant G418

2．5 亞麻抗性植株的PCR檢測

對獲得的抗性植株，經過繼代增殖培養及伸長生長培養后，對獲得的6個株系的組培苗進行了轉基因檢測。使用無菌苗的葉片提取基因組DNA，用AtNDPK2的特異性引物進行PCR檢測，來擴增目的基因特異性片段。結果有4個株系擴增出了目的條帶，陽性率為66．67%。檢測的圖片見圖5。

圖5 亞麻轉AtNDPK2基因抗性植株PCR電泳圖Fig．5 PCR profile of transgenetic resistance plant withAtNDPK2

從圖2可知，陰性對照無擴增條帶，lane 1～6是抗性植株的擴增情況，其中1，4，5，6與陽性質粒DNA擴增出的帶與AtNDPK2基因大小相符，實驗結果表明，1，4，5，6株系AtNDPK2基因已轉入亞麻基因組中。而2，3株系未擴增出目的條帶，AtNDPK2基因未轉化成功。

3 討論

本研究中植物表達載體上攜帶有目前植物基因工程中使用最廣泛的篩選基因nptⅡ基因，nptⅡ基因編碼新霉素磷酸轉移酶，若該基因整合進亞麻基因組中，它能使Kan(卡那霉素)、geneticin(G418)、Neo(新霉素)等氨基糖苷類抗生素磷酸化，使轉化細胞以及再生植株具有抗這三種抗生素的能力［6］。Jin-Zhuo Dong等對亞麻的兩種篩選抗生素進行了比較研究，結果發現，亞麻下胚軸對Kan和G418顯示出兩種不同的反應，Kan是一個比G418溫和的篩選劑［7］。這一結果在桃的遺傳轉化中也有類似的報告［8］。但國內研究者的報道與以上結果有所不同，李學寶等人在對亞麻下胚軸進行轉化研究時發現在含Kan50 mg·L-1的選擇培養基上篩選獲得Kan抗性苗，并檢測到GUS基因活性表達［9］。王玉富等在利用農桿菌介導進行亞麻轉基因研究時，在篩選培養基中加入了50 mg·L-1的Kan和1 000 mg·L-1的頭孢霉素［10］。本試驗中對兩種篩選抗生素Kan和G418也進行了比較研究，當Kan濃度增加到200 mg·L-1時，亞麻的增殖系數仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素。G418濃度為50 mg·L-1時，培養30d后，下胚軸已經枯死，因此選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1，此結果與前人報道在濃度上有所差異，這應該與不同的亞麻基因型、外植體，甚至不同的試劑有關。

一般認為預培養對外植體的轉化是有利的，它可以促進外植體細胞分裂，分裂狀態的細胞會更容易整合外源DNA，從而提高外源基因的轉化率［11］。姬妍茹等的研究發現，是否進行預培養直接影響著受體的一周成活率，外植體子葉和下胚軸的GUS瞬時表達率在預培養2 d后開始出現下降趨勢，雖然不進行預培養有100%的GUS瞬時表達，但外植體生長狀態不佳，成活率低，難于進行再分化［12］。Bretagne-Sagnard等人在GUS染色試驗的結果中發現，預培養和剝皮同樣能夠使瞬時轉化率提高［13］。Dong等人在試驗研究中發現未經過預培養的下胚軸切口兩端有較強的染色效果，預培養時間超過6天的染色強度反而降低［14］。本研究結果發現預培養對轉化率是有影響的，預培養2-3d為最佳時間，當低于或高于這一時間時，轉化率都會有所下降，這與前人的研究結果稍有差異。

［1］ MOON H，LEE B，CHOI G，et al．NDP kinase 2 interacts with two oxidative stress-activated MAPKs to regulate cellular redox state and enhances multiple stress tolerance in transgenic plants［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100(1):358-363．

［2］ YANG K A，MOON H，KIM G，et al．NDP kinase 2 regulates expression of antioxidant genes in arabidopsis［J］．Proceedings of the Japan Academy，Series B，2003，79(3):86-91．

［3］ TANG L，KIM M D，YANG K S，et al．Enhanced tolerance of transgenic potato plants overexpressing nucleoside diphosphate kinase 2 against multiple environmental stresses［J］．Transgenic Research，2008，17(4):705-715．

［4］ UM M O，PARK T I，KIM Y J，et al．Particle bombardmentmediated transformation of barley with an Arabidopsis NDPK2 cDNA［J］．Plant Biotechnology Reports，2007，1(2):71-77．

［5］ 王文斌．紫花苜蓿耐逆性及AtNDPK2、codA基因的遺傳轉化研究［D］．咸陽:西北農林科技大學，2009．WANG Wenbin．The studies on alfalfa abiotic stress tolerance and genetic transformation ofAtNDPK2 and codA genes［D］．Xianyang:Northwest A＆F University，2009．

［6］ 張松，溫孚江，朱常香，等．抗生素對大白菜組織培養形態發生的影響［J］．山東農業大學學報，2000，31(4):358-388．ZHANG Song，WEN Fujing，ZHU Changxiang，et al．Effects of antibiotics on morphogenesis of chinnese cabbage(Brassica Campestris Ssp．Pekinensis(Lour)Olsson)in tissue culture［J］．Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science)，2000，31(4):385-388．

［7］ JIN-ZHUO DONG，ALAN MCHUGHEN．An improved procedure for production of transgenic flax plants usingAgrobacterium Tumefaciens［J］．Plant Science，1993，88:61-71．

［8］ R SCORZA，P H MORGENS，J M CORDTS，et al．Agrobacterium-mediated transformation of peach (Prunus persicaL．Batsch)leaf segments，immature embryos and long-term embryogenic callusin vitroCell［J］，Dev Biol，1990，(26):829-834．

［9］ 李學寶，陳光榮，金波．亞麻下胚軸離體培養和轉化的研究［J］．武漢植物學研究，1995，13(4):344-348．LI Baoxue，CHEN Guangrong，JIN Bo．Plant Regeneration and Transformation of Linum Usit Atissimum Hypocotylin vitro［J］．Journal of Wuhan Botanical Research，1995，13(4):344-348．

［10］ 王玉富，周思君，劉燕，等．利用農桿菌介導法進行亞麻轉基因的培養基研究［J］．中國麻作，2000，22(1):14-16．WANG Yufu，ZHOU Sijun，LIU Yan，et al．Study on flax genetic transformation byAgrobacteriumTumefaciens［J］．China’s Fiber Crops，2000，22(1):14-16．

［11］ 張勇，周小云，何江，等．影響根癌農桿菌介導甜瓜轉化NP-1基因的外部因子研究［J］．生物技術，2004，14(4):9-11．ZHANG Yong，ZHOU Xiaoyun，HE Jiang，et al．Study on factors affecting Agrobectrium-mediated cantaloup tranformation of NP-1gene［J］．Biotechnology，2004，14(4):9-11．

［12］ 姬妍茹，趙軍，劉偉偉，等．應用直接分化再生系統進行亞麻轉基因技術的研究［J］．生物技術通報，2008，(1):128-132．JI Yanru，ZHAO Jun，LIU Weiwei，et al．Study on flax transform technology by system of shoot differentiate directly from explant［J］．Biotechnology Bulletin，2008，(1):128-132．

［13］ BRETAGNE-SAGNARD B，CHUPEAU Y．Selection of transgenic flax plants is facilitated by spectinomycin［J］．Transgenic Research，1996，5:131-137．

［14］ DONG JINZHUO，MCHUGHEN A．Patterns of transformation intensity on flax hypocotyls inoculated withAgrobacterium Tumefaciens［J］．Plant Cell Reports，1991，10:555-560．