利用生物信息學研究Tgfβ信號通路在人類結直腸癌發生發展中的作用＊

胡海星，張仕超，朱 旋，范雄偉*

(1．長沙環境保護職業技術學院，湖南 長沙410004;2．湖南師范大學 蛋白質化學及魚類發育生物學教育部重點實驗室 心臟發育研究中心，湖南 長沙410081)

我國結直腸癌死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第四位，且發病率一直呈上升趨勢，嚴重危害人類健康。結直腸癌的發生與飲食、環境、遺傳等因素密切相關，其發病機理一直以來是腫瘤研究領域的研究熱點之一，Tgfβ信號通路在結直腸癌中發生發展中發揮重要作用以被人所熟知，但在人類結直腸癌發生中具體分子機制和貢獻大小還遠未闡明。

轉化生長因子β(Transforming growth factor)超家族是一類包含了相似結構、功能的多肽生長因子，其中包括TGF－βs、生長分化因子(Growth and differentiation factor，GDFs)、骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)等30多個成員［1，2］。這些配體分子總是先結合并激活膜上的二型受體(TgfβRⅡ，BmpRⅡ)，二型受體招募一型受體(TgfβRI，BmpRI)二聚化而磷酸化下游的R－Smads(Smad1，2，3，5，8)，進而與co－Smad(Smad4)結合，以異源多聚體的形式，共同入核調節下游如P27、P21、BIM等靶基因，對細胞的增殖、凋亡、遷移、免疫和炎癥發揮重要作用。而I－Smads(Smad6、Smad7)通過競爭結合一型受體而抑制R－Smads的活化，由于多數CKI與抑癌基因均為Tgfβ下游靶點。所以Tgfβ信號被廣泛的認為是抗癌信號。誠然，體內外實驗證明，腸的組織或者細胞中 缺 失Smad4［3－6］、Smad3［7］、BMPR1［8］、TgfβRI［9］由于逃避了Tgfβ信號的控制，均能發展為癌，而TgfβRII［10－12］與GDF15［13，14］缺失的小鼠，雖然不能直接發展成癌，但對結直腸癌的肝轉移與耐藥方面產生重要貢獻。在以往的報道中，幾乎所有的經典Tgfβ信號超家族的成員均無一例外的呈現出其抑癌作用，并且，具有抑制經典信號的Smad7在結直腸癌發生恰好表現為促癌作用。盡管這樣，這并不能證明在人類結直腸癌發生就是源自于Tgfβ信號喪失。Abadie C［15］等表明，TgfβRI與直腸癌發生風險并無關系，Fukushima T［16］等在人類直腸癌突變分析中也沒有發現Smad2，Smad3，Smad6，Smad7的改變。此外，在腸癌的發生當中Tgfβ信號成員也并不是表現為一致性的下調，比如Tgfβ1、Tgfβ2在腸癌中就呈現上調趨勢，且表達水平與惡性程度相關。顯而易見，基于基因敲除或者轉基因技術，雖然可以逐一的分揀出Tgfβ信號通路各個成員對腫瘤發生的功能。但是反向遺傳學的手段卻人為的改變的發病的始動因素，無法真實吻合發病的分子事件。所以并不能解決腫瘤的發病機制從而也很難尋找到干預疾病的真實方法。除此以外，同一信號通路中的各個成員，在發揮功能的同時存在上下游的相互依存關系。當某些下游的分子發生改變時，上游的信號轉導將極有可能重新建立新的傳導通路。在Tgfβ信號通路中，有報道經典的信號通道在受體環節受阻將激活非經典信號通道，其間涉及到RAS、MAPK、AKT等，而這些信號恰好與經典的Tgfβ信號通路相反，他們經常作為癌基因和促癌因子被報道。所以真實病理情況下，Tgfβ信號在腸癌的發生發展中作用比人想象的要復雜的多。為了了解Tgfβ信號在腸癌的發生中的真實作用，需要有一種系統的方法，首先在腸癌的發生早期病理標本中，全面檢測所有Tgfβ信號成員的變化，然后依據各自不同功能，才可能推測Tgfβ信號通路在腸癌的發生中真實的作用機制。

本文通過生物信息學的方法，獲取已經報道的腸癌早期芯片結果，在轉錄水平上檢測了27個Tgfβ經典信號成員的表達變化關系。發現在腸癌的發生早期，Smad2 Smad4的下調阻斷經典的Tgfβ信號的抗腫瘤作用，同時配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調可能刺激旁路分子的激活導致腫瘤的發生。

1 材料與方法

1．1 材料

所有結直腸癌有關的全基因組表達芯片數據均來源于GEO數據庫(http://www．ncbi．nlm．gov/geo/)。本研究中設定搜索關鍵詞為“colorectal cancer”，限制研究類型為“expression profiling by array”

1．2 方法

1．2．1 文獻納入標準 符合以下標準的數據集將納入研究對象①數據集必須是有文獻支持的全基因組mRNA表達芯片數據;②每套數據均有腸癌疾病組織和正常組織對照;③本次均考慮原始或者經標準化數據集;④每套數據集必須包括3個以上樣本;⑤數據集采用的樣本必須是人體活檢腸癌組織。根據篩選標準，總共篩選到12組符合標準的基因芯片數據。

1．2．2 數據處理 在GEO的supplementary file中下載基因芯片的CEL數據壓縮包，并解壓至一個文件夾中待用，同時下載TXT格式的樣本原始數據;若下載數據處沒有顯示CEL數據壓縮包，則在scope、format、amount中分別選擇samples、soft、full下載該樣本TXT格式的原始數據，通過UltralEdit軟件處理的soft文件顯示基因的名稱，每套樣本數據的基本信息記錄在提供的excel里。采用每一個數據組跟正常組平均值進行比較對樣本進行標準化處理。

1．2．3 數據分析 根據KEGG中Tgfβ信號通路成員的信息，在24組基因芯片結果中篩選出共同研究基因，使用T－TEST函數計算每一個基因表達差異的顯著性，P＜0．05，則表示差異具有顯著性意義。最后根據標準化后的平均數值統計其上下調基因。

2 結果

2．1 利用生物信息學在芯片中獲取待測Tgfβ信號通路成員的表達數據

根據納入標準，最終篩選出12組基因芯片結果。利用KEGG選擇Tgfβ信號通路共27經典通路的成員，在12組釣取所有成員基因芯片結果數據，與12個正常組芯片的平均值，獲得每一組芯片該成員分子相對表達量信息，羅列于表1。

表1 Tgfβ信號通路分子在早期結直腸癌芯片中表達變化Tab．1 The changes of Tgfβsignaling pathway factor in the microarray of early colorectal cancer

2．2 Tgfβ信號通路中成員在人類早期結直腸癌的表達差異分析

對篩選27個基因進行差異性分析，發現與對照組相比在心臟疾病中，顯著性上調基因包括TGFβR2、TGFβR3、GDF3(P＜0．05)，GDF2也有上調的趨勢(P=0．051)顯著性下調基因有Smad2、GDF15(P＜0．05)，Smad4也有下調的趨勢(P=0．057)，其他成員均有下調或者上調現象但均未達到顯著性意義，(圖1)

圖1 統計分析基因的表達水平(*P＜0．05#P＜0．06)Fig．1 Statistical Analysis determined the levels of gene expression

3 討論

Tgfβ信號通路的經典成員具有抑制結腸癌的功能，但在人類結腸癌的發生過程當中Tgfβ信號通路是否真正參與其中，這需要系統性對整個信號通路成員在結腸癌的發生早期病理標本中，檢測所有各成員的表達變化關系，才能找到Tgfβ信號通路調節結腸癌發生的線索為臨床早期診斷、干預帶來積極效應。廣泛的收集人類早期結腸癌標本，并通過常規的分子生物學檢測所有成員的表達變化并不是一件容易的事。但是生物信息學的發展，使我們能在數據庫中直接看到一個標本在全轉錄本中的表達變化，而這些已發表的芯片數據結果其一致性和可靠性已經過了同行的審驗與認可，但是提供芯片數據的作者往往只關注其自身的科學問題，而芯片內含的其他方面數據價值卻被擱置。所以從以往的數據中提出新問題，得到新結論，是一種值得去做的工作。且從別人的數據中得到支持自己的證據，由于排除了主觀的傾向性，二度利用的數據比首次利用更為客觀。基于此，我們找到12組符合納入標準的早期結腸癌芯片，并發現結腸癌早期Tgfβ信號通路的經典成員的Smad2 Smad4表達下降，而Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調。研究表明，Smad4存在明顯的抗癌作用［3］，缺失了Smad4的小鼠，導致嚴重的腸癌［4］，結腸癌細胞中喪失了Smad4將容易發生肝臟轉移［5］。當Smad4表達下降時，有可能導致經典的Tgfβ信號喪失效應，而與此同時Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調也有可能不再轉導經典的信號，而激活旁路。研究發現，當Smad4缺失時，BMP信號將會激活Rho AKT信號［17－19］，而促進腫瘤形成。由此根據我們結果，我們推測在結腸癌早期，一方面，Smad2 Smad4的下調阻斷經典的Tgfβ信號的抗腫瘤作用，另一方面，配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調可能刺激旁路分子的激活從在腫瘤的發生中發揮重要作用(圖2)。提示旁路的抑制與經典通路的重新激活的聯合策略有可能在干預早期結腸癌帶來貢獻。

圖2 Tgfβ信號通路在結腸癌發生中的作用機制Fig．2 The roles of Tgfβsignaling pathway in the occurrence of colorectal cancer

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