VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達及其與腫瘤轉移的關系

夏 冰， 趙 軍， 王乃會， 馮 劍， 董偉達

(1.南通大學附屬建湖醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 江蘇 建湖 224700 2.江 蘇 省 人 民 醫 院， 江蘇 南京 210029)

VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達及其與腫瘤轉移的關系

夏 冰1， 趙 軍1， 王乃會1， 馮 劍1， 董偉達2

(1.南通大學附屬建湖醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 江蘇 建湖 224700 2.江 蘇 省 人 民 醫 院， 江蘇 南京 210029)

目的:探討血管內皮生長因子(VEGF－C)及其受體(VEGFR－3)在喉癌組織中的表達及其與喉癌臨床病理特征的關系。方法:選取2012年5月至2014年5月在我院接受手術治療的喉癌患者30例并提取患者喉癌組織及癌旁組織，以及30例健康體檢者的正常組織。采用免疫組化染色法檢測VEGF－C和VEGFR－3在不同組織中的表達情況。結果:VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織和正常組織(P＜0.01);VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達強度與臨床分期和淋巴結轉移有關(P＜0.05);與腫瘤大小、病理分級等無關(P＞0.05);VEGF－C和VEGFR－3在喉癌組織中的表達呈正相關(r=0.899，P＜0.01);淋巴管密度(LVD)隨VEGF－C和VEGFR－3表達增強而升高(F=9.833，P＜0.01)。結論:VEGF－C、VEGFR－3在喉癌組織中的異常表達可能與腫瘤轉移有關。

喉 癌; 血管內皮生長因子C; 血管內皮生長因子受體; 淋巴管密度

喉癌(Laryngeal carcinoma)是耳鼻喉－頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，近年來的發病發病率和復發率持續升高。喉癌可以采取手術治療、放化療及生物免疫治療，雖然可以緩解病情，但遠期療效并不理想，患者的生存質量沒有獲得明顯改善［1］。目前普遍認為，臨床分期是影響喉癌患者預后的主要因素。但有研究表明，淋巴管生成在惡性淋巴侵襲和轉移過程中起重要作用［2］。血管內皮生長因子C(VEGF－C)及其受體(VEGFR－3)的異常表達可促進血管內皮細胞的生成，刺激淋巴管擴張［3］。為了探究VEGF－C和VEGFR－3的表達與喉癌臨床特征的關系，本研究采用免疫組化法檢測喉癌組織中VEGF－C、VEGFR－3的表達情況，為預防喉癌的復發轉移提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:選取2012年5月至2014年5月在我院手術的30例喉癌患者的腫瘤組織、癌旁組織(距腫離瘤切緣＞0.5cm)，所有標本均經病理診斷證實為鱗狀細胞癌，癌旁組織經病理證實為炎癥和正常組織，患者術前均未接受過放化療或其他治療。選擇同期我院接受手術治療30例患者正常喉黏膜組織標本作為對照。

1.2 實驗方法:應用免疫組織化學染色方法:所有標本經4%甲醛固定、石蠟包埋，常規4μm制成連續切片，用二甲苯脫去蠟、梯度乙醇脫水。用新鮮配置3%的甲醇過氧化氫處理;VEGF－C、VEGFR－3和D2－40均采用枸櫞酸緩沖液修復抗原;加一抗(稀釋濃度VEGF－C、VEGFR－3為1:100，D2－40為1:50)，加入山羊血清，4℃下孵育過夜;PBS沖洗，加二抗10min，三抗10min，PBS沖洗，加DAB液顯色，加入蘇木素復染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察細胞染色。

1.3 判定方法:由兩位病理科醫師在未知臨床資料的情況下判定，將陽性著色細胞所占百分比與細胞著色強度結合進行判定，得出陽性率。①陽性細胞百分數為5個視野中陽性細胞的平均數占視野中細胞數的比例，陽性細胞率≤25%記為0分，26%～50%記為1分，51%～70%記為2分，＞70%記為3分。②按多數陽性細胞的染色強度計分:無色記為0分，多數陽性細胞呈淺棕黃記為1分，多數陽性細胞呈棕黃記為2分，多數陽性細胞呈棕褐記為3分，將以上兩項積分相加:0分為陰性，＞0分為陽性，并計算陽性百分率。③D2－40陽性淋巴管判斷標準及計數方法:參照Weidner方法進行微淋巴管計數，在高倍鏡(400×)下觀察并對淋巴管進行計數，每份計數4個視野，取其平均值為LVD (D2－40陽性脈管數/HP)。

1.4 統計學方法:數據采用SPSS13.0進行分析處理，計數資料用(±s)表示，采用χ2檢驗或t檢驗。應用Spearman等級相關分析進行相關性分析，以P＜0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 VEGF－C與VEGFR－3在不同組織中的表達情況:VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織、癌旁組織及正常組織中都有表達(H=38.66，H=36.33，P＜0.01)。VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達率分別為73.5%和72.1%，均顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統計學意義(χ2=32.06，P＜0.01;χ2=26.43，P＜0.01)。D2－40在喉癌組織中的表達為(8.14±3.21)，顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統計學意義(H=29.71，P＜0.01)。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40在癌旁組織和正常組織中的表達無顯著差異(t= 0.170，P＞0.05)。見表1。

表1 VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達 n(%)

2.2 VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表達與喉癌病理特征的關系:30例喉癌標本中，男18例，女12例;吸煙量＞400支/年的患者為14例，≤400支/年的為8例;癌腫直徑＞3cm的患者為24例，≤3cm的為6例;病理分級:G1級7例，G2級13例，G3級10例;跨聲門型癌6例，聲門上型癌12例，聲門型癌12例;TNM期:Ⅰ期9例，Ⅱ期5例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例;淋巴轉移22例，無淋巴轉移8例。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表達與臨床分期、淋巴轉移及臨床分型有關(P＜0.05)，與病理分級、吸煙史、腫瘤的大小和性別無關(P＞0.05)，見表2。

表2 VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達水平與臨床病理之間的關系

2.3 VEGF－C、VEGFR－3和 LVD的相關性分析: Spearman相關分析顯示，VEGF－C與VEGFR－3兩者表達率呈正相關(r=0.899，P＜0.01)。多元線性回歸分析顯示，LVD表達水平與VEGF－C和VEGFR－3呈正相關，而且隨VEGF－C與VEGFR－3表達增強而升高，差異具有統計學意義(YD=0.692XC+0.561XR－0.0663，F=9.833，P＜0.01)。

3 討 論

VEGF－C是用Flt4親和層析法分離得到與肝素結合的生長因子，可以促使血管內皮細胞分裂、增殖，促進新生血管的形成［4］。VEGFR－3是酪氨酸蛋白激酶家族受體，屬于VEGF－C特異性受體，主要位于淋巴管的內皮細胞［5］。D2－40是一種淋巴管內皮細胞標記物，可以特異地與癌胚抗原M2A結合［6］。

在正常情況下，淋巴管內皮細胞為靜止狀態，而在外傷、炎癥或者腫瘤情況下，淋巴管內皮細胞會遷移至局部組織并在生長因子作用下形成淋巴管［7］。癌細胞侵入到淋巴管被認為是基于增強癌細胞的侵襲性或是癌細胞產生消化酶對其基質破壞，惡性腫瘤細胞產生的VEGF－C與VEGFR－3結合后快速產生磷酸化，誘導胞質內信號的傳導，使DNA有絲分裂旺盛，引起淋巴管內皮細胞增生，同時使淋巴管的通透性增強，因此腫瘤淋巴道轉移的可能性也隨之增加。此外，惡性腫瘤細胞通過侵襲周邊病灶的淋巴管系統而進入淋巴液，進而形成淋巴結轉移［8］。

大量研究表明，VEGF－C在多種腫瘤組織中比正常組織表達高［9］。有研究者在35個腫瘤標本中共檢測到19個標本具有VEGF－C mRNA的表達。還有研究證實，LVD可以作為乳腺癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌等腫瘤淋巴管生成的重要指標。近年來研究表明，VEGF－C及其受體VEGFR－3在癌組織中的高表達與LVD及淋巴結轉移呈現正相關性。

結合本研究，VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統計學意義(P＜0.01)。我們推測，VEGF－C和VEGFR－3的表達與喉癌轉移有關。研究還顯示，D2－40在喉癌組織中的表達為顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統計學意義(H=29.71，P＜0.01)。結果提示，D2－40可能參與喉癌的發生和發展。此外，我們發現VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達呈正相關。說明VEGF－C和VEGFR－3的表達與腫瘤大小、病理分級、吸煙量及性別無相關性。這提示我們，VEGF－C可能通過多條信號通路激活活淋巴上皮細胞內膜上的受體而引起腫瘤細胞淋巴管的增生。

我們推測，腫瘤細胞可能通過旁分泌途徑分泌VEGF－C，并與淋巴管內皮細胞上相關受體結合，使VEGFR－3酪氨酸酶產生磷酸化，導致腫瘤周圍淋巴管生成和擴張，增加腫瘤轉移擴散的可能性。因此，深入研究淋巴管內皮特異性標記物D2－40，并通過阻斷VEGF－C和VEGFR－3信號傳導通路表達，可能會成為阻斷癌細胞經淋巴道轉移的重要手段。但這一機制還需要我們在今后的實踐中深入探索。

［1］趙安平，任杰兵，向軍，等.喉癌中SP100表達及其與臨床病理關系［J］.現代生物醫學進展，2014，14(9):1696～1699.

［2］Guski H，Hufnagl P，Kaufmann O，et al.AgNOR analysis of atypical ductal hyperplasia and intraductal carcinoma of the breast［J］.Anal Quant Cytol Histol，2000，22(3):206～212.

［3］成偉，梁中敏.喉癌組織微血管密度及血管形成相關因子的檢測及臨床意義［J］.河北醫學，2008，12:1393～1397.

［4］白云飛，覃潔，彭詩東.喉癌組織中Survivin和VEGF的表達及其臨床意義［J］.中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2012，33(1):5～9.

［5］Hirakawa S，Brown L F，Kodarna S，et al.VEGF－C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites［J］.Blood，2007，109(3): 1010～1017.

［6］邱亞雙，周慧芳.HIF－lα和VEGF在喉癌中的表達及其與血管生成的關系［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，06:389～393.

［7］武彥昭，施惠晶，景尚華，等.喉癌組織中VEGF－C及其受體VEGFR－3和D2－40的表達及意義［J］.山東醫藥，2013，41:4～7.

［8］董凱峰，呂欣，宋冬梅，等.LOX與VEGF蛋白在人喉鱗癌中的表達及其相關性研究［J］.現代中西醫結合雜志，2014，06:571～572.

［9］Han L，Su W，Huang J，et al.Doxycycline inhibits inflammation－induced lymphangiogenesis in mouse cornea by multiple mechanisms［J］.PLoS One，2014，30，9(9):e108931

Expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in Laryngeal Carcinoma and its Relationship with the Metastasis

XIA Bing， ZHAO Jun， WANG Naihui， et al
(Jianhu Hospital Affiliated to Nantong University，Jiangsu Jianhu224700，China)

Laryngeal carcinoma; VEGF－C; VEGFR－3; Lymphatic vessel density

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.026

1006－6233(2015)05－0785－04

Abstract:Objective:To investigate the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the tissues of laryngeal carcinoma and its relationship with the clinical pathology of tumor.Method:The tissues of laryngeal carcinoma and para－carcinoma of patients with laryngeal carcinoma treated in our hospital from May 2012 to 2014 were selected.And another 30 normal tissues of the healthy people were chosen as the control group.Then the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in different tissues were detected by immunohistochemical staining method.Result:The positive expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the laryngeal carcinoma were significantly higher than those of the tissues in para－carcinoma and the control group(P＜0.01);The expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma were related to the clinical stages and lymph node metastasis(P＞0.05).There was no relevance of the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 with tumor size or pathological grades(P＜0.05);There was positive correlation between the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma(r=0.899，P＜0.01);with the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 upregulating，the LVD increasing(F=9.833，P＆lt;0.01).Conclusion:The abnormal expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma may be associated with tumor metastasis.